N-cadherin介導(dǎo)GDNF保護(hù)DA能神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、目的:膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glia cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)能有效地保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)細(xì)胞。已知,GDNF發(fā)揮對(duì)DA能神經(jīng)細(xì)胞特異性保護(hù)作用時(shí),激活的胞內(nèi)信號(hào)通路主要為PI3K/AKT。我們的前期實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)干擾N-cadherin表達(dá)后,GDNF對(duì)DA能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用受到影響,提示N-cadherin能夠介導(dǎo)GDNF保護(hù)DA能神

2、經(jīng)細(xì)胞作用。因而,我們提出GDNF是否也能夠通過(guò)N-cadherin來(lái)激活PI3K/AKT信號(hào)通路?
　　 方法:首先,用基因沉默的方法干擾N-cadherin的表達(dá),將MN9D細(xì)胞分為四組:空白對(duì)照組、空脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,用western blot方法檢測(cè)phospho-N-cadherin(Tyr860)和phospho-Akt(Ser473)細(xì)胞的含量。其次,通過(guò)不同劑量的GDNF作用相同時(shí)間,將成年SD大鼠

3、各分為六組:PBS組、空白對(duì)照、25ng劑量組、50ng劑量組、75ng劑量組和100ng劑量組;干擾后的MN9D細(xì)胞分為六組:BSA作用組、空白對(duì)照、25ng/ml劑量組、50ng/ml劑量組、75ng/ml劑量組和100ng/ml劑量組。根據(jù)相同劑量GDNF作用的不同時(shí)間,將SD大鼠分為七組:PBS作用組、空白對(duì)照、15min作用組、30min作用組、45min作用組、60min作用組和2h作用組;干擾后的MN9D細(xì)胞分為六組:BS

4、A組、空白對(duì)照、5min作用組,15min作用組、30min作用組、45min作用組;用western blot檢測(cè)phospho-N-cadherin(Tyr860)和phospho-Akt(Ser473)細(xì)胞的含量。最后,將MN9D細(xì)胞分為四組:質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+GDNF組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、GDNF組、空白對(duì)照。用細(xì)胞免疫化學(xué)的辦法來(lái)檢測(cè)phospho-N-cadherin(Tyr860)、N-cadherin、phospho-Akt(Ser4

5、73)和Akt在細(xì)胞中的含量。
　　 結(jié)果:首先,western blot結(jié)果顯示,隨著GDNF作用時(shí)間和劑量的變化,phospho-N-cadherin(Tyr860)和N-cadherin(a.a.853-864)細(xì)胞的含量也相應(yīng)變化,提示GDNF能夠使N-cadherin的Tyr860位點(diǎn)磷酸化。其次,干擾了N-cadherin表達(dá)后,western blot結(jié)果顯示Phospho-N-cadherin(Tyr860)和P

6、hospho-Akt(Ser473)細(xì)胞的含量均降低。此外,免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果也顯示Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)細(xì)胞的含量均降低;總N-cadherin細(xì)胞的含量也降低而總Akt細(xì)胞的含量不變。最后,在GDNF作用下,western blot結(jié)果顯示,劑量曲線中Phospho-N-cadherin(Tyr860)和Phospho-Akt(Ser473)細(xì)胞的含量均在GDNF