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文檔簡介
1、目的:研究膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)與17β-Estradiol(E2)協(xié)同保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)細(xì)胞的作用,并探討PI3-K/Akt信號通路介導(dǎo)其協(xié)同保護(hù)作用的可能機(jī)制。
方法:本研究以培養(yǎng)的新生1~3天的SD大鼠中腦黑質(zhì)腦片為研究對象,腦片培養(yǎng)至7天時,碘化丙啶(PI)染色檢測培養(yǎng)腦片中細(xì)胞的活力
2、,并取細(xì)胞活力良好的腦片做后續(xù)實驗。首先以200μmol/L6-羥多巴胺(6-OHDA)作用于已培養(yǎng)7天的腦片1小時誘導(dǎo)細(xì)胞損傷,然后將培養(yǎng)的腦片分為8組:正常對照組、溶劑對照組、GDNF組、E2組、GDNF+E2組、Wortmannin(PI3-K特異性阻斷劑)+GDNF組、Wortmannin+E2組、Wortmannin+GDNF+E2組,各組腦片再培養(yǎng)15min后進(jìn)行后續(xù)實驗,其中Wortmannin在GDNF或(和)E2加入前
3、1小時加入。免疫熒光雙標(biāo)染色觀察黑質(zhì)致密部(substantia nigracompacta,SNc)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)與Akt共表達(dá)情況;Western Blot方法檢測TH、p-Akt、Bcl-2、Bad、Procaspase-3的表達(dá)情況。
結(jié)果:中腦腦片培養(yǎng)至第7天時,可見邊緣細(xì)胞清晰并有長的突起伸出,貼壁良好,PI染色結(jié)果顯示細(xì)胞活力較好;免疫熒光染色結(jié)果顯示腦片SN
4、c中有TH+細(xì)胞;免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示SNc中所有TH+細(xì)胞均表達(dá)Akt,TH+/Akt+細(xì)胞為胞漿著色;Western Blot檢測結(jié)果顯示在GDNF+E2組,TH的表達(dá)比單用GDNF或E2時顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);GDNF+E2組中Bcl-2、Procaspase-3的表達(dá)比單用GDNF或E2時增高,而Bad的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);GDNF、E2及GDNF+E2組中Akt磷酸化水平都是升
5、高的,與相應(yīng)的溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);所有加入Wortmannin組與相應(yīng)的未加Wortmannin各組相比,TH、Bcl-2、Procaspase-3的表達(dá)是降低的,Bad的表達(dá)是升高的,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:在本實驗條件下,GDNF與E2對DA能神經(jīng)細(xì)胞有協(xié)同保護(hù)作用;PI3-K/Akt信號通路介導(dǎo)了GDNF與E2的協(xié)同保護(hù)作用,其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)其下游的凋亡調(diào)控因子Bcl
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