體外循環(huán)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)節(jié)苷脂的腦保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、近年來(lái)，雖然隨著醫(yī)療設(shè)備與技術(shù)的不斷進(jìn)步，心臟外科總的死亡率和并發(fā)癥在持續(xù)下降，但術(shù)后神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)生率卻基本無(wú)變化，明顯的和亞臨床的圍手術(shù)期腦損傷依然是一個(gè)未解決的問(wèn)題。而目前對(duì)體外循環(huán)(CPB)相關(guān)的腦病理生理變化和腦的并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制仍缺乏深入的了解，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥仍缺乏有效的治療和預(yù)防措施，因此CPB的腦損傷和腦保護(hù)一直是人們研究的熱點(diǎn)。本研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)頸靜脈引流，尾動(dòng)脈灌注，成功建立了經(jīng)濟(jì)、預(yù)充量小、可靠、重復(fù)

2、性好的小動(dòng)物CPB模型，從形態(tài)功能學(xué)、分子生物學(xué)等方面對(duì)CPB對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的腦保護(hù)作用及機(jī)制研究進(jìn)行了探討。同時(shí)在臨床上，通過(guò)研究GM1對(duì)老年患者CPB下心臟手術(shù)圍術(shù)中S100B、Tau蛋白的變化及對(duì)腦氧代謝的影響，探討GM1是否具有腦保護(hù)作用及可能機(jī)制。 (一)大鼠CPB模型的建立。選用成年健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，利用特制微型動(dòng)物膜式氧合器，經(jīng)右頸靜脈插管引流，尾動(dòng)脈插管灌注建立小預(yù)充量的CP

3、B，轉(zhuǎn)流時(shí)間1h，股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及血?dú)?、電解質(zhì)的變化。結(jié)果顯示，90％大鼠順利建立CPB模型，CPB期間血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，動(dòng)脈血?dú)饧半娊赓|(zhì)指標(biāo)正常，基本達(dá)到理想的CPB標(biāo)準(zhǔn)。停機(jī)后呼吸和心血管循環(huán)功能順利恢復(fù)，獲得了24小時(shí)的較長(zhǎng)時(shí)間生存。本方法建立的大鼠CPB模型切實(shí)可行，具有簡(jiǎn)單實(shí)用、重復(fù)性好的特點(diǎn)，是進(jìn)行CPB相關(guān)性臟器損傷，尤其是腦損傷機(jī)制研究可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 (二)形態(tài)功能學(xué)的動(dòng)物基礎(chǔ)研究。成年健康雄性SP

4、F級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為CPB組、CPB+GM1組、輸血組和假手術(shù)組。建立大鼠CPB模型，在預(yù)充液中加入GM120 mg/kg。24 h后取腦組織進(jìn)行檢測(cè)。(1)采用透射電鏡技術(shù)觀測(cè)海馬和皮層的超微結(jié)構(gòu)，以探討GM1對(duì)CPB腦損傷的保護(hù)作用。結(jié)果示，CPB后神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體明顯減少，線粒體腫脹，空泡化，嵴斷裂，溶解，消失，細(xì)胞膜崩解；神經(jīng)絲模糊、突觸間隙模糊不清，出現(xiàn)較多神經(jīng)細(xì)胞凋亡。GM1干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)輕度改善

5、，突觸間隙增寬，凋亡細(xì)胞減少。(2)研究CPB后腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)的變化及GM1干預(yù)后對(duì)其的影響。結(jié)果顯示，CPB后腦組織中，乳酸脫氫酶由正常的38.21±3.61(U/mg)增加到62.17±6.71(P<0.01)，給予GM1后下降到51.63±5.92(P<0.05)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)；MDA由正常的2.14±0.81(nmol/mg)升高到6.76±1.31(P<0.01)，給予GM1后下降到4.53±

6、0.93(P<0.05)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)；而SOD、GSH-Px的活性分別由正常的1173.72±268.75、128.32±42.74(mmol/h/mg)降低到586.74±133.46、73.19±18.67(P<0.01),給予GM1后分別回升到723.19±189.65、89.41±22.16，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)。提示CPB腦損傷的過(guò)程中氧自由基是重要的致病因素，GM1可以明顯減

7、少氧自由基的產(chǎn)生和促進(jìn)SOD、GSH-Px的產(chǎn)生。(3)觀察CPB后腦組織的的Na+-K+-ATP酶活性變化及神經(jīng)節(jié)苷脂干預(yù)后對(duì)其的影響。結(jié)果顯示，CPB組腦組織中的Na+-K+-ATP酶活性由正常的17.03±4.17(mol·Pi/g·protein/h)下降到12.45±2.64(P<0.01)，CPB+GM1組下降到14.72±3.29(P<0.05)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)。提示CPB可抑制Na+-K+-AT

8、P酶活性，GM1可起到穩(wěn)定細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的作用。(4)研究CPB后腦組織的NOS活性的變化及GM1干預(yù)后對(duì)其的影響。結(jié)果顯示，CPB組腦組織中的iNOS活性由正常的16.47±2.52(pmol/mg/prot/min)增加到69.84±8.73(P<0.01)，CPB+GM1組則增加到57.86±7.79(P<0.01)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)；CPB組腦組織中的cNOS活性由正常的57.74±8.78

9、(pmol/mg/prot/min)下降到32.67±6.61(P<0.01)，CPB+GM1組則下降到42.72±7.23(P<0.05)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)； CPB組腦組織中的NO含量由正常的258.91±48.17(pmol/mg·prot)增加到713.74±98.43(P<0.01)，CPB+GM1組則增加至0523.74±87.36(P<0.01)，與CPB組比較有顯著差異(P<0.05)。提示CPB

10、腦損傷與iNOS產(chǎn)生大量的NO導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用有關(guān)：GM1在一定程度降低了腦中活化的iNOS含量，減少了NO的分泌釋放，具有一定的腦保護(hù)作用。(5)基于分子生物學(xué)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)，研究CPB后海馬、皮層炎性因子表達(dá)的變化及GM1干預(yù)后對(duì)其的影響。結(jié)果顯示，海馬、皮層TNF-α、IL-1β、ICAM-1和IL-10 mRNA表達(dá)在假手術(shù)組和輸血組的表達(dá)水平低，兩組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)；在CPB組和CPB+GM1組，海馬、

11、皮層TNF-α、IL-1β、ICAM-1和IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，同時(shí)海馬的表達(dá)量較皮層的表達(dá)量更明顯(P<0.05)，但兩組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)?？梢姡珻PB可誘導(dǎo)海馬、皮層TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-10 mRNA表達(dá)，導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞因子蛋白分泌增加，從而啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)途徑，引起腦損傷，尤其以海馬損傷更明顯。GM1不影響腦組織TNF-α、ICAM-1、IL-1β

12、、IL-10mRNA表達(dá)，不能導(dǎo)致相應(yīng)的細(xì)胞因子蛋白分泌減少；GM1的腦保護(hù)作用不是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的途徑來(lái)起作用的。 (三)臨床研究。觀察研究GM1對(duì)老年患者CPB心臟手術(shù)圍手術(shù)期中S100B、Tau蛋白的變化及對(duì)腦氧代謝的影響，從而探討其是否具有腦保護(hù)作用及可能機(jī)制。擇期在CPB下行主動(dòng)脈瓣和/或二尖瓣置換術(shù)的患者40例，年齡>60歲，隨機(jī)分為對(duì)照組和GM1組，每組20例。分別于轉(zhuǎn)機(jī)前(T0)、主動(dòng)脈阻斷后5分鐘(T1)、主

13、動(dòng)脈開放后5分鐘(T2)、停機(jī)后即刻(T3)、停機(jī)后60分鐘(T4)、停機(jī)后24h(T5)測(cè)頸內(nèi)靜脈球部、橈動(dòng)脈血?dú)?，?jì)算出腦氧供和氧耗比值(CBF/CMRO2)及腦氧耗和腦糖耗比值(CMRO2/CMRGLU)。用ELISA法測(cè)定頸內(nèi)靜脈球部血清中S100B、Tau蛋白水平。結(jié)果顯示，GM1組在T1、T2、T3、T4、T5與對(duì)照組相比，血清S100B、Tau蛋白的濃度均下降并有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異(P>0.05)。SjvO2變化：與T0比較，

14、T1時(shí)兩組均升高，T2、T3、T4下降，停機(jī)24h恢復(fù)正常；組間比較，對(duì)照組于T2、T3、T4下降較GM1組明顯(P<0.05)。CBF/CMRO2變化：與T0比較，T1時(shí)兩組均升高，T2、T3、T4下降，停機(jī)24h恢復(fù)正常；組間比較，T2、T3、T4下降較GM1組明顯(P<0.05)。CMRO2/CMRGLU變化：與T0比較，T1時(shí)兩組均升高，T2、T3、T4下降，停機(jī)24h恢復(fù)正常；組間比較，對(duì)照組于T2、T3、T4下降較GM1組明

15、顯(P<0.05)。提示老年患者CPB術(shù)后S100B、Tau蛋白釋放明顯增加，CPB可導(dǎo)致腦氧代謝的過(guò)程性失衡，標(biāo)記反映老年患者CPB后的腦損傷；GM1可以減少S100B、Tau蛋白的表達(dá)分泌，能夠更好地維持CPB過(guò)程中的腦氧供需平衡，起到一定的腦保護(hù)作用。 綜上所述，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床檢測(cè)均顯示CPB可導(dǎo)致一定程度的腦損傷，CPB腦損傷的機(jī)制與氧化應(yīng)激、抑制Na+-K+-ATP酶活性、iNOS介導(dǎo)的NO神經(jīng)毒性作用以及炎癥反應(yīng)、腦