磁性納米四氧化三鐵顆粒聯(lián)合5-溴漢防已甲素在逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥中的作用及機理研究.pdf

1、目的：
　　 多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）惡性血液病化療失敗和復發(fā)的主要原因，逆轉(zhuǎn)MDR對白血病的治療有重要意義。本研究旨在探討磁性納米四氧化三鐵顆粒（magneticnanoparticle of Fe3O4，F(xiàn)e3O4-MNPs）和5-溴漢防己甲素（5-bromotetrandrine，BrTet）單獨及聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)、外協(xié)同化療藥物逆轉(zhuǎn)白血病細胞株K562/AO2細胞多藥耐藥的療效，研究其逆

2、轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機理，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.采用甲基四唑藍法（MTT）法檢測Fe3O4-MNPs、BrTet單獨或聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同化療藥物柔紅霉素（daunorubicin，DNR）對K562/AO2細胞和K562細胞增殖影響的變化，并計算IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（fold reversal，F(xiàn)R）；
　　 2.采用光鏡觀察細胞形態(tài)，瓊脂糖凝膠電泳觀察細胞凋亡“DNA ladder”；采用流式細

3、胞儀（flow cytometry FCM）檢測K562細胞、K562/AO2細胞凋亡率以及細胞內(nèi)DNR濃度；采用FCM檢測正常人外周血造血干細胞在藥物作用后細胞內(nèi)DNR濃度；
　　 3.建立裸小鼠皮下移植瘤模型，比較Fe3O4-MNPs、BrTet在體內(nèi)的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，觀察藥物對裸小鼠重要臟器的影響；
　　 4.采用Western blot法檢測藥物作用后K562/AO2細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、wt p53

4、、Fas、Caspase-3和耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的蛋白表達；
　　 5.采用Real time RT-PCR方法檢測藥物作用后K562/AO2細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、wt p53、Fas、Caspase-3和耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的mRNA表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.K562和K562/AO2細胞的IC50分別為0

5、.56±0.04mg/L和18.18±0.02mg/L，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨或聯(lián)合）處理后DNR對K562細胞的IC50均無明顯變化；加用Fe3O4-MNPs和BrTet處理后DNR對K562/AO2細胞的IC50分別為4.23±0.05mg/L、2.424±0.03mg/L，兩藥聯(lián)合作用后DNR對K562細胞的IC50值為1.024±0.08mg/L，逆轉(zhuǎn)劑處理前后DNR對K562/AO2細胞的IC50有顯著差異

6、。
　　 2.單用DNR時K562細胞內(nèi)DNR平均熒光強度為105.10±15.41，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨或聯(lián)合）處理后細胞內(nèi)DNR平均熒光強度較單用DNR組細胞無明顯提高；K562/AO2細胞內(nèi)DNR平均熒光強度為29.53±3.65，F(xiàn)e3O4-MNPs以及BrTet聯(lián)合DNR分別作用于K562/AO2細胞48小時后，細胞內(nèi)DNR平均熒光強度較單用DNR組細胞明顯提高，兩藥聯(lián)合作用后細胞內(nèi)DNR平均熒光

7、強度較單用DNR組、Fe3O4-MNPs逆轉(zhuǎn)組、BrTet逆轉(zhuǎn)組均明顯提高；單用DNR時PBHSC細胞內(nèi)DNR平均熒光強度為302.71±14.12，說明DNR對PBSCT細胞的毒性比K562/AO2細胞大；加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨或聯(lián)合）處理后較單用DNR組均無明顯提高。
　　 3.K562細胞以及K562/AO2細胞成瘤率均為100％；對于K562移植瘤，各組之間腫瘤抑制率差異無顯著性；對于K562/AO2

8、移植瘤，F(xiàn)e3O4-MNPs協(xié)同DNR、BrTet協(xié)同DNR及Fe3O4-MNPs聯(lián)合BrTet協(xié)同DNR組均可明顯抑制移植瘤的增殖，腫瘤抑制率分別為28.17±0.98％、43.88±0.47％、62.274±0.48％，而單用DNR組的腫瘤抑制率僅為3.67±0.08％，差異有顯著性；同時腫瘤組織病理觀察顯示聯(lián)合逆轉(zhuǎn)組腫瘤細胞死亡明顯，各實驗組心、腎、脾等臟器無明顯病理改變。
　　 4.當不同藥物分別依次作用于K562細胞4

9、8小時后，空白對照組、單用Fe3O4-MNPs、BrTet時K562細胞凋亡率分別為4.33±0.45％、4.60±0.62％、4.274±0.81％，單用DNR時K562細胞凋亡率為51.534±0.71％，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（單獨或聯(lián)合）處理后K562細胞凋亡率與單用DNR組相比差異無統(tǒng)計學意義；當不同藥物分別依次作用于K562/AO2細胞48小時后，空白對照組、單用Fe3O4-MNPs、BrTet時細胞凋亡率分別

10、為2.454±0.35％、2.724±0.42％、2.684±0.67％，單用DNR時細胞凋亡率為6.744±0.38％，與單用DNR相比，F(xiàn)e3O4-MNPs、BrTet聯(lián)合DNR組K562/AO2細胞凋亡率明顯增加，分別為13.14±0.29％、57.24±1.16％，差異具有統(tǒng)計學意義，DNR、Fe3O4-MNPs、BrTet三者聯(lián)合時K562/AO2細胞凋亡率最高，較DNR單用及聯(lián)合Fe3O4-MNPs、BrTet組均明顯增加達

11、67.83±1.37％，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 5.和K562細胞相比，K562/AO2細胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平較高，Bax，wtp53及Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平較低，F(xiàn)as的mRNA表達水平較低，蛋白量無明顯差異；Fe3O4-MNPs可下調(diào)K562/AO2細胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平，上調(diào)Bax及Fas mRNA和蛋白的表達，對wtp53和Caspase-3 mRNA和蛋白表達

12、水平無明顯影響；BrTet能上調(diào)K562/AO2細胞的Fas mRNA和蛋白水平，對Bcl-2，Bax，wt p53及Caspase-3的轉(zhuǎn)錄和蛋白無明顯影響；
　　 6.K562/AO2細胞的Mdr1，Mrp1，Mrp2，Mrp4和Mrp5的mRNA水平明顯較K562細胞高，而Mrp3mRNA表達水平低于K562細胞，兩者的Bcrp和Lrp表達水平無明顯差別。Fe3O4-MNPs對K562/AO2細胞的Mdr1、Mrp1、Mr

13、p2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平均有下調(diào)作用，與DNR聯(lián)合應(yīng)用后下調(diào)作用更加明顯，BrTet單用對Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平也有明顯的下調(diào)作用，與DNR聯(lián)合應(yīng)用后，以上幾種基因的mRNA表達下調(diào)更加顯著，但蛋白水平僅Mdr1、Mrp1表達下調(diào)，Mrp2、Mrp4、Mrp5明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.10ug/mL Fe3O4-MNPs對白血病細胞株K562細胞

14、無增敏作用，在體外、體內(nèi)均可逆轉(zhuǎn)耐藥株K562/AO2對DNR的耐藥，不增加造血干細胞內(nèi)的化療藥物濃度說明其對腫瘤細胞具有一定的靶向性，對正常細胞的影響小，安全性較好，體內(nèi)實驗也未增加化療藥物的損害。
　　 2.0.35μg/ml BrTet對白血病敏感細胞株K562無增敏作用，在體外、體內(nèi)均觀察到可明顯逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細胞株K562/AO2對化療藥物的耐藥性，不增加造血干細胞內(nèi)的化療藥物濃度，體內(nèi)實驗也未增加對重要臟器的損害，具

15、有良好的安全性。
　　 3.Fe3O4-MNPs與BrTet兩者聯(lián)合逆轉(zhuǎn)K562/AO2對DNR的耐藥，在體外和體內(nèi)均顯示出明顯的協(xié)同作用。且此濃度下兩種藥物單獨及聯(lián)合應(yīng)用均不增加化療藥物對造血干細胞的殺傷及細胞內(nèi)的化療藥物濃度，聯(lián)合應(yīng)用在增加療效的同時并未增加毒副作用，有較好的安全性。
　　 4.BrTet逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細胞株K562/AO2細胞耐藥的作用機制可能主要為從基因和蛋白水平抑制了多藥耐藥相關(guān)基因Mdr1、M

16、rp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的表達，其中Mdr1、Mrp1是主要的作用位點；BrTet并非通過誘導細胞凋亡來克服耐藥，但可通過增加細胞內(nèi)化療藥物濃度從而增強了化療藥物的誘導細胞凋亡作用，在對凋亡相關(guān)基因的影響方面，僅對Fas轉(zhuǎn)錄與表達水平有輕度的上調(diào)作用，對Bcl-2，Bax，wt p53和Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄與表達均無明顯影響。
　　 5.Fe3O4-MNPs從基因和蛋白水平對多種耐藥相關(guān)基因Mdr1、Mrp1

17、、Mrp2、Mrp4、Mrp5均有下調(diào)作用，在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后此作用更強。Fe3O4-MNPs本身無誘導白血病細胞凋亡的作用，但可增強化療藥物的誘導細胞凋亡作用，可下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax mRNA和蛋白水平，上調(diào)Fas mRNA和蛋白水平，但作用均較弱，在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后此作用明顯增強，對wt p53和Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平無明顯的影響，但在聯(lián)合化療藥物后明顯上調(diào)。說明Fe3O4-MNPs克服腫瘤耐藥的機