粘細(xì)菌中利用CRISPR-Dcas9系統(tǒng)抑制基因表達(dá).pdf

1、粘細(xì)菌是原核生物中具有最復(fù)雜社會(huì)運(yùn)動(dòng)的一類細(xì)菌，具有復(fù)雜的細(xì)胞行為、多種信號(hào)調(diào)控途徑、能產(chǎn)生大量活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，但其代時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)及遺傳操作困難，其基因功能和化合物的生產(chǎn)沒能有效地探究和開發(fā)。
　　CRISPR-cas9是微生物的一種的免疫系統(tǒng)，經(jīng)過不斷地發(fā)展，將其改造成了一種新型基因編輯工具。將Cas9蛋白的核酸酶位點(diǎn)突變(變?yōu)閐ead cas9簡(jiǎn)稱dcas9)以后，CRISPR-dcas9不能切割靶基因，但能抑制該基因的表達(dá)，

2、進(jìn)而發(fā)展成一種新的基因調(diào)控工具。當(dāng)在dCas9蛋白上融合不同的效應(yīng)元件時(shí)能實(shí)現(xiàn)不同的目的，如融合RNA聚合酶的ω亞基，使其在靶基因啟動(dòng)子上游招募RNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。CRISPR-cas9/dcas9具有無物種限制，基因調(diào)控方式多樣，基因修飾率高，可實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)調(diào)控操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，在粘細(xì)菌中引入該系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的探究。
　　論文選用的CRISPR-cas9系統(tǒng)來源于釀膿鏈球菌，cas9基因的GC含量?jī)H為31

3、％,而黃色粘球菌DK1622基因組的平均GC含量為67％，cas9基因在黃色粘球菌中對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA出現(xiàn)頻率較低。cas9基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后(稱為mxcas9)，GC含量提高到61％，密碼子對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA出現(xiàn)頻率達(dá)到最大。mxcas9基因通過Red/et技術(shù)將核酸酶位點(diǎn)突變，再利用整合質(zhì)粒將其插入到細(xì)菌基因組。sgRNA利用pZJY41質(zhì)粒表達(dá)，該質(zhì)粒由PMF1質(zhì)粒改造而來。利用構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制pilA和dif

4、A基因時(shí)，抑制菌株與野生型菌株表型有顯著差異。抑制0049基因時(shí)，抑制菌株和野生菌株之問不形成界限。在粘細(xì)菌中構(gòu)建好的CRISPR-dcas9能在一定程度上抑制靶基因的表達(dá)，但不能完全沉默基因。為提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)的抑制效率，需對(duì)CRISPR-dcas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。
　　提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)對(duì)靶基因的抑制效率，首先提高sgRNA和dcas9在細(xì)胞中的濃度，將它們的啟動(dòng)子都改為強(qiáng)啟動(dòng)子（sgRNA用的是強(qiáng)

5、啟動(dòng)子pili，僅需更換dcas9啟動(dòng)子）。更換啟動(dòng)子后利用該系統(tǒng)抑制pilA基因，pilA基因的表達(dá)量并沒有明顯的下降。之后，利用sgRNA靶向同一基因的不同部位，發(fā)現(xiàn)越靠近基因末端，抑制效率越低?？傮w而言，在粘細(xì)菌中構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)能使靶基因的表達(dá)量下降約2/3。
　　丙酰輔酶A和甲基丙二酸單酰輔酶A分別是埃博霉素A和埃博霉素B的底物，它們?cè)诩?xì)胞中的濃度維持較低水平，利用CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制它們的

6、其他支路以提高埃博霉素的產(chǎn)量。丙酰輔酶A是脂肪酸合成的重要底物，利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的翻譯起始位點(diǎn)后，與對(duì)照菌株相比，埃博霉素A的產(chǎn)量有一定的提高，但埃博霉素總產(chǎn)量卻降低了，原因是菌株的生長(zhǎng)受到了明顯影響。利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的ORF末端，埃博霉素A產(chǎn)量明顯提高，與埃博霉素B產(chǎn)量幾乎相同（ZE9菌株中埃博霉素A∶埃博霉素B≈1∶3）。甲基丙二酸單酰輔酶A可以被甲基丙二酸單酰輔酶A變