利用CRISPR-Cas9和Cre-lox系統(tǒng)構(gòu)建偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗.pdf

1、偽狂犬病毒是α-皰疹病毒屬成員，基因組由150kb左右的DNA雙鏈構(gòu)成。偽狂犬病毒感染豬只后會(huì)誘發(fā)宿主嚴(yán)重的傳染性疾病，給全世界生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。雖然長(zhǎng)期以來偽狂犬病毒疫苗得到了廣泛應(yīng)用并很好地控制了該病的流行，但近年來偽狂犬病突然在我國經(jīng)過疫苗免疫的豬場(chǎng)爆發(fā)并在全國范圍內(nèi)流行，成為目前我國生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨的最大危害之一，這表明傳統(tǒng)疫苗失去了對(duì)偽狂犬病的免疫保護(hù)作用，更多研究報(bào)道也進(jìn)一步說明該病毒的基因組或主要抗原基因已經(jīng)發(fā)

2、生變異。傳統(tǒng)制備偽狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多個(gè)毒力基因，并經(jīng)過共幾十輪的低熔點(diǎn)瓊脂糖空斑純化，耗時(shí)耗力。因此亟需更高效經(jīng)濟(jì)的病毒疫苗制備策略來應(yīng)對(duì)變異毒株的爆發(fā)和流行等問題。
　　本課題構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9和Cre/lox基因編輯系統(tǒng)的快速制備偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗的新方法，同步敲除偽狂犬病毒變異毒株P(guān)RV-HNX的TK和gE兩個(gè)毒力基因，成功制備了偽狂犬病毒雙基因缺失活疫苗侯選株，對(duì)當(dāng)下流行的偽

3、狂犬病有較好的免疫保護(hù)作用。主要步驟概括如下:
　　一，利用CRISPR/Cas9和同源重組修復(fù)機(jī)制同時(shí)將綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(mCherry)分別重組到PRV-HNX基因組gE和TK基因位點(diǎn)。
　　二，利用單細(xì)胞流式分選和低熔點(diǎn)瓊脂糖挑斑純化得到PRV-ΔgE-ΔTK-GFP-mCherry重組毒。提取重組毒基因組DNA，PCR鑒定重組病毒是否純化。
　　三，再利用Cre/lox重組系統(tǒng)將重組病毒基因