基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)的Rapamycin調(diào)控下的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng).pdf

1、目的:靶向特定位點(diǎn)的基因激活對(duì)于了解復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)、發(fā)現(xiàn)基因的上下游調(diào)控因子、構(gòu)建動(dòng)物模型、治療疾病、醫(yī)療以及工業(yè)上應(yīng)用都具有很大意義。通過構(gòu)建在rapamycin誘導(dǎo)下，時(shí)間空間上調(diào)控特定靶基因表達(dá)的系統(tǒng)，我們可以精確調(diào)控靶基因在特定時(shí)期的表達(dá)程度；構(gòu)建相關(guān)動(dòng)物模型；通過誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)上調(diào)，可以治療惡性腫瘤性疾病，為腫瘤治療的臨床轉(zhuǎn)化研究夯實(shí)基礎(chǔ)。
　　方法:我們分別構(gòu)建了靶向多個(gè)基因的sgRNAs、PSL690-dCas9-

2、FKBP質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱dCas9-FKBP，anchor質(zhì)粒）、PSL690-FRB-effector domain（簡(jiǎn)稱FRB-effector domain， activator質(zhì)粒）。將sgRNA、anchor質(zhì)粒和activator質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，在rapamycin誘導(dǎo)下，F(xiàn)KBP和FRB結(jié)合，sgRNA牽引著轉(zhuǎn)錄因子VP64促進(jìn)下游基因mRNA表達(dá)。提取細(xì)胞基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtim

3、e-PCR）法檢測(cè)dCas9-FKBP和FRB-VP64系統(tǒng)上調(diào)靶基因表達(dá)效應(yīng)；加入不同濃度（0 nM、100 nM、200 nM、500 nM、1000 nM和2000 nM）rapamycin,使用CCK-8法檢測(cè)加入rapamycin1d,2d,3d,4d后，該藥物對(duì)293FT細(xì)胞的毒性；為了提高dCas9-FKBP和FRB-VP64系統(tǒng)上調(diào)基因表達(dá)的能力，我們將FRB-VP64進(jìn)行改造，構(gòu)建了FRB-p65、FRB-p65-VP

4、64和FRB-VP64-VP64。將anchor質(zhì)粒和activator質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)質(zhì)粒基礎(chǔ)表達(dá)量；又設(shè)計(jì)了靶向多個(gè)基因的sgRNA，轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，Realtime-PCR檢測(cè)相應(yīng)靶基因在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)程度。
　　結(jié)果:Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dCas9-FKBP和FRB-VP64組成的系統(tǒng)可以靶向上調(diào)VEGFA、IL1RN和ASCL1靶基因mRN

5、A表達(dá)含量；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度rapamycin對(duì)293FT細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)100 nM、200 nM、500 nM、1000 nM和2000 nM rapamycin對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力沒有影響；將activator質(zhì)粒進(jìn)行改造，使anchor質(zhì)粒dCas9-FKBP重新與activator質(zhì)粒FRB-p65、FRB-p65-VP64和FRB-VP64-VP64分別配對(duì)，分別比較這幾個(gè)系統(tǒng)上調(diào)基因mRNA表達(dá)量效果，Realt

6、ime-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)dCas9-FKBP和FRB-VP64-VP64配對(duì)的系統(tǒng)上調(diào)基因表達(dá)效果最好；將此系統(tǒng)應(yīng)用到HeLa細(xì)胞中，能夠靶向上調(diào)多個(gè)基因（bak1、Caspase9、bim和Bad）mRNA水平。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了能夠上調(diào)靶基因mRNA水平的dCas9-FKBP和FRB-VP64、FRB-p65、FRB-p65-VP64、FRB-VP64-VP64 anchor和activator質(zhì)粒；Realtime-PCR