泡沫病毒轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控宿主細(xì)胞周期并受宿主細(xì)胞microRNA的調(diào)控.pdf

1、病毒是一種病原體,由于自身包裝能力的限制,所以必須依賴于宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖與復(fù)制,并且對(duì)宿主細(xì)胞造成破壞。與此相反,宿主細(xì)胞在病毒進(jìn)入到自身后,馬上會(huì)啟動(dòng)其防御機(jī)制,抵抗、削弱、甚至清除病毒感染。本論文主要以泡沫病毒為研究工具,研究該類病毒對(duì)宿主細(xì)胞,特別是宿主細(xì)胞周期的抑制作用。以及宿主microRNA對(duì)病毒相關(guān)基因的調(diào)控及對(duì)病毒復(fù)制的影響。本研究還初步揭示了RNA沉默抑制因子,即番茄叢矮病毒的P19蛋白,對(duì)宿主細(xì)胞周期相關(guān)基因有顯著的

2、調(diào)控作用。
　　 Borf1蛋白是牛泡沫病毒編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子,可影響其自身及病毒結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。但目前對(duì)Borf1在宿主細(xì)胞周期上是否發(fā)揮作用還不清楚。在本研究中,我們通過(guò)構(gòu)建人胚腎293穩(wěn)定表達(dá)Borf1的細(xì)胞系來(lái)研究其對(duì)宿主細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)Borf1可顯著引發(fā)細(xì)胞在G1/G0的阻滯,并且降低S期細(xì)胞的比例。用半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),Borf1可在mRNA水平下調(diào)cyclin A2,cyclin B

3、1,cyclin E1和CDC2,及上調(diào)CDK2和E2F-1的表達(dá)。蛋白水平的分析進(jìn)一步核實(shí)上述結(jié)果,并且發(fā)現(xiàn)Borf1還可抑制P15蛋白表達(dá)。因此,Borf1通過(guò)影響周期相關(guān)蛋白表達(dá),在G2-M及G1-S限制位點(diǎn)上發(fā)揮作用,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞G1期阻抑。
　　 番茄叢矮病毒的P19蛋白不僅是一個(gè)重要的病毒致病因子,而且還可作為RNA干擾(RNAi)的抑制因子。這種作用是通過(guò)限制細(xì)胞內(nèi)的小RNA,比如小干擾RNA(siRNAs)和mi

4、croRNA(miRNAs)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是目前人們對(duì)P19蛋白是否可能對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響還不知。在本研究中,我們構(gòu)建了一株p19穩(wěn)定表達(dá)的293細(xì)胞系,即293-p19。流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)在293細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)P19蛋白可顯著引發(fā)細(xì)胞周期的G2/M阻滯。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示293-p19細(xì)胞的DNA復(fù)制及細(xì)胞生長(zhǎng)均受到顯著的抑制。此外,研究還發(fā)現(xiàn)p19可使人胚腎293細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)譜發(fā)生改變。其中包括上調(diào)cyclin

5、A1,CDK2,CDK4,CDK6,p27,cyclin D2,cyclin D3 and E2F1,及下調(diào)p15,cyclin A,cyclin B1和cyclin E1的表達(dá)。因此,我們的研究結(jié)果提示,p19有可能靶向多個(gè)周期相關(guān)調(diào)控蛋白從而引發(fā)細(xì)胞的G2/M阻滯。
　　 microRNA(miRNA)是一類大小為21-25nt的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因的抑制作用。通常microRNA可通過(guò)抑制靶序列的翻譯,或引發(fā)

6、靶序列的降解來(lái)達(dá)到其負(fù)調(diào)控目的。雖然目前microRNA分子已知的很多,但真正明確其功能的卻很少。另外,有關(guān)microRNA對(duì)泡沫病毒作用的研究報(bào)道也極其有限。為此,我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件對(duì)人泡沫病毒(HFV)基因組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)}tFV的轉(zhuǎn)錄激活子Bell(Tas)的編碼區(qū)上有一個(gè)has-miR-491-5p的靶位點(diǎn)。將靶序列置于EGFP基因的3'非編碼區(qū)(UTR),用化學(xué)合成的及載體表達(dá)的has-miR-491-5p均可顯著抑制

7、EGFP的基因表達(dá)。用化學(xué)修飾的特異性miRNA抑制劑及過(guò)量表達(dá)p19,均可有效解救has-miR-491-5p引發(fā)的基因抑制。研究還發(fā)現(xiàn),has-miR-491-5p介導(dǎo)的基因抑制發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后mRNA水平,而非蛋白質(zhì)表達(dá)水平。不僅如此,has-miR-491-5p還可有效抑制Bell在質(zhì)粒及病毒中的表達(dá)。該系統(tǒng)為進(jìn)一步檢測(cè)has-miR-491-5p抑制}tFV病毒的復(fù)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 總之,病毒早期感染產(chǎn)生的某些重要的調(diào)

8、控蛋白如Borf1和P19,不僅可作用于病毒基因組復(fù)制本身,而且還可作用于宿主細(xì)胞周期,通過(guò)改變周期蛋白的表達(dá)來(lái)引發(fā)細(xì)胞周期的阻抑。此外,宿主細(xì)胞對(duì)病毒的侵入性感染也呈現(xiàn)多種防御性作用機(jī)制,其中之一就是在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)針對(duì)病毒的miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因抑制。如miR-491對(duì)HFV Bell蛋白的抑制作用,就有可能是宿主miRNA通過(guò)限制轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)抑制HFV病毒的復(fù)制。miR-491介導(dǎo)的這種抑制作用有可能會(huì)為病毒建立潛伏感