MYH9-RD一家系臨床特點(diǎn)分析、基因突變檢測和致病機(jī)理研究.pdf

1、第一章非肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾病家系收集、家系診斷和臨床特點(diǎn)分析
　　 目的：收集一非肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾病(MYH9-RD)家系患者的詳細(xì)遺傳資料。通過分析該MYH9-RD家系的臨床特點(diǎn)、遺傳方式和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)來對(duì)該家系進(jìn)行診斷，以探討該家系MYH9-RD的致病機(jī)理。
　　 方法：登記家系所有成員并進(jìn)行詳細(xì)的臨床體征檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測。每一個(gè)家系成員進(jìn)行臨床體征包括白內(nèi)障、神經(jīng)性耳聾、異常出血、腎損害等檢查及其它并發(fā)

2、癥調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估等；分別采用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀法和手工法計(jì)數(shù)血小板數(shù)量，同時(shí)分析巨大血小板和包涵體的特點(diǎn)和百分率；應(yīng)用染色體核型分析技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞包涵體和血小板的形態(tài)特點(diǎn)和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：通過實(shí)驗(yàn)室評(píng)估和臨床表現(xiàn)顯示：該家系為常染色體顯性遺傳性MYH9-RD，外周血染色體核型分析正常。調(diào)查的該MYH9-RD家系4代32人中有15人患病。所有患者均具有典型的“血小板減少、巨

3、大血小板和粒細(xì)胞包涵體”三聯(lián)癥，都有輕至中度的出血傾向，并且與血小板的數(shù)量或大小無關(guān)。而且大多數(shù)患者的臨床表型高度復(fù)雜，其中一些患者還伴有嚴(yán)重的白血病、青光眼、心功能不全、轉(zhuǎn)氨酶升高、血脂升高、哮喘、鼻炎及白內(nèi)障等多種疾病，不同于目前國內(nèi)外報(bào)道的家系。MYH9-RD家系患者機(jī)數(shù)血小板數(shù)明顯低于鏡數(shù)血小板數(shù)(P<0.01)。電鏡下可見清晰的巨大血小板和包涵體的超微結(jié)構(gòu)，包涵體電鏡下的結(jié)構(gòu)為橢圓形或梭形，位于中性粒細(xì)胞的邊緣。此外，正常對(duì)照

4、者血小板數(shù)量、形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常，而且中性粒細(xì)胞中未見包涵體。
　　 結(jié)論：通過臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)分析，該家系MYH9-RD診斷成立。該家系具有規(guī)模大、患者人數(shù)多、臨床表型復(fù)雜多樣的特點(diǎn)，是一個(gè)不同于目前國內(nèi)外報(bào)道的大家系。該家系將為MYH9相關(guān)疾病的深入研究奠定基礎(chǔ)。此外，為了正確反映巨大血小板患者的血小板數(shù)量，我們應(yīng)使用人工計(jì)數(shù)法而不是細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀法來計(jì)數(shù)血小板的數(shù)量。
　　 第二章 MYH9-RD家系MYH9基因

5、突變檢測與分析
　　 目的：探討和分析-MYH9-RD家系非肌球蛋白重鏈9(MYH9)基因的突變情況。
　　 方法：簽定知情同意書后，采集患者和家系成員的外周血。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序的方法對(duì)15例家系患者M(jìn)YH9基因的全部40個(gè)外顯子和側(cè)翼區(qū)進(jìn)行突變檢測和分析，選擇家系正常個(gè)體為對(duì)照。測序結(jié)果通過DNAMAN軟件與Genebank中的正常MYH9基因序列進(jìn)行比對(duì)。
　　 結(jié)果：家系患者M(jìn)YH9基因的所有外顯

6、子與側(cè)翼區(qū)均未檢測到致病性突變，只有25號(hào)和18號(hào)外顯子各有一同義突變。
　　 結(jié)論：本家系可能存在新的基因突變類型或此類疾病的另一個(gè)新的致病基因或其它原因，其臨床表型復(fù)雜多樣可能與此有關(guān)。對(duì)該家系的深入研究將對(duì)進(jìn)一步闡明該遺傳性疾病形成的分子機(jī)制具有重要的意義。
　　 第三章 MYH9-RD家系非肌性肌球蛋白重鏈Ⅱ A在中性粒細(xì)胞中的定位與表達(dá)
　　 目的：觀察該MYH9-RD家系患者非肌性肌球蛋白重鏈Ⅱ A(

7、nonmuscle myosin heavy chain-ⅡA，NMMHC-Ⅱ A)在中性粒細(xì)胞中的定位和表達(dá)，闡明MYH9-RD中性粒細(xì)胞包涵體的性質(zhì)和形成特點(diǎn)，以探討MYH9-RD的致病機(jī)制。
　　 方法：分離MYH9-RD患者和正常對(duì)照者外周血中性粒細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)，觀察MYH9-RD患者與正常對(duì)照者NMMHC-ⅡA在胞漿中的分布情況；應(yīng)用Westernblot技術(shù)分析MHY9-RD中患者和正常對(duì)照者之間NMMH

8、C-Ⅱ A蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：MYH9-RD患者中性粒細(xì)胞胞漿中存在“橢圓形及梭形”包涵體的形態(tài)和輪廓，與瑞特姬姆薩染色顯示的包涵體形狀、大小基本一致，但更為清晰；而正常對(duì)照中性粒細(xì)胞胞漿中的熒光呈彌散分布，無叢集現(xiàn)象，未見包涵體；Westernblot結(jié)果顯示患者NMMHC-Ⅱ A含量較正常對(duì)照降低。
　　 結(jié)論：免疫熒光技術(shù)和Westernblot技術(shù)均顯示患者和正常人之間MYH9基因編碼蛋白NMMHC-Ⅱ

9、A在中性粒細(xì)胞中的表達(dá)和分布存在異常，提示NMMHC-Ⅱ A的顯性負(fù)性效應(yīng)導(dǎo)致了中性粒細(xì)胞包涵體的產(chǎn)生，表明本家系MYH9-RD患者中性粒細(xì)胞包涵體的主要構(gòu)成成份和性質(zhì)是非肌性肌球蛋白Ⅱ A，NMMHC-Ⅱ A是本家系致病機(jī)理的一個(gè)重要方面。雖然本家MYH9基因40個(gè)外顯子和側(cè)翼區(qū)未檢測到致病性突變，但本家系的致病基因有可能還是由MYH9基因異常導(dǎo)致的。同時(shí)，免疫熒光染色技術(shù)較瑞特姬姆薩染色法更敏感，特異性更強(qiáng)，對(duì)診斷MYH9-RD具有

10、重要的意義。
　　 第四章 MYH9-RD家系血小板中NMMHC-Ⅱ A和膜糖蛋白的檢測與分析
　　 目的：通過分析該MYH9-RD家系患者血小板膜糖蛋白表達(dá)差異和NMMHC-ⅡA在血小板中的分布特點(diǎn)，來進(jìn)一步探討該家系血小板與MYH9-RD之間的致病機(jī)理。
　　 方法：采取家系患者和正常對(duì)照者的外周血，并分離血小板。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MYH9-RD家系患者與正常個(gè)體之間的血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa(CD41/

11、61)、GPⅠ a(CD49b)、GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ(CD42a)GPⅠ b(CD42b)和GPⅣ(CD36)進(jìn)行檢測，運(yùn)用免疫熒光方法觀察NMMHC-ⅡA在正常人和患者之間的分布。
　　 結(jié)果：家系患者血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa(CD41/61)、GPⅠa(CD49b)、GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ(CD42a)GPⅠ b(CD42b)和GPⅣ(CD36)檢測結(jié)果正常，血小板膜糖蛋白表達(dá)量在家系患者和正常對(duì)照者之間，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

12、>0.05)；但家系患者個(gè)體之間血小板的活化水平不同。免疫熒光結(jié)果顯示患者血小板中NMMHC-Ⅱ A在血小板中央?yún)^(qū)染色分布均勻，但是在血小板的外圍染色較密集；而正常人結(jié)果顯示NMMHC-ⅡA在血小板中是呈均勻分布的。
　　 結(jié)論：家系患者中血小板中NMMHC-ⅡA蛋白分布存在異常，提示家系患者巨大血小板的形成可能與NMMHC-Ⅱ A異常分布有關(guān)；雖然家系患者和正常個(gè)體之間的血小板膜糖蛋白表達(dá)沒有差異，但是家系患者之間血小板的活化