MYH9-RD一家系臨床特點分析、基因突變檢測和致病機理研究.pdf

1、第一章非肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾病家系收集、家系診斷和臨床特點分析
　　 目的：收集一非肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾病(MYH9-RD)家系患者的詳細遺傳資料。通過分析該MYH9-RD家系的臨床特點、遺傳方式和實驗室特點來對該家系進行診斷，以探討該家系MYH9-RD的致病機理。
　　 方法：登記家系所有成員并進行詳細的臨床體征檢查和實驗室檢測。每一個家系成員進行臨床體征包括白內(nèi)障、神經(jīng)性耳聾、異常出血、腎損害等檢查及其它并發(fā)

2、癥調(diào)查和實驗室評估等；分別采用自動血細胞計數(shù)儀法和手工法計數(shù)血小板數(shù)量，同時分析巨大血小板和包涵體的特點和百分率；應(yīng)用染色體核型分析技術(shù)進行細胞學(xué)診斷；應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察中性粒細胞包涵體和血小板的形態(tài)特點和超微結(jié)構(gòu)特點。
　　 結(jié)果：通過實驗室評估和臨床表現(xiàn)顯示：該家系為常染色體顯性遺傳性MYH9-RD，外周血染色體核型分析正常。調(diào)查的該MYH9-RD家系4代32人中有15人患病。所有患者均具有典型的“血小板減少、巨

3、大血小板和粒細胞包涵體”三聯(lián)癥，都有輕至中度的出血傾向，并且與血小板的數(shù)量或大小無關(guān)。而且大多數(shù)患者的臨床表型高度復(fù)雜，其中一些患者還伴有嚴重的白血病、青光眼、心功能不全、轉(zhuǎn)氨酶升高、血脂升高、哮喘、鼻炎及白內(nèi)障等多種疾病，不同于目前國內(nèi)外報道的家系。MYH9-RD家系患者機數(shù)血小板數(shù)明顯低于鏡數(shù)血小板數(shù)(P<0.01)。電鏡下可見清晰的巨大血小板和包涵體的超微結(jié)構(gòu)，包涵體電鏡下的結(jié)構(gòu)為橢圓形或梭形，位于中性粒細胞的邊緣。此外，正常對照

4、者血小板數(shù)量、形態(tài)和結(jié)構(gòu)均正常，而且中性粒細胞中未見包涵體。
　　 結(jié)論：通過臨床表現(xiàn)和實驗室特點分析，該家系MYH9-RD診斷成立。該家系具有規(guī)模大、患者人數(shù)多、臨床表型復(fù)雜多樣的特點，是一個不同于目前國內(nèi)外報道的大家系。該家系將為MYH9相關(guān)疾病的深入研究奠定基礎(chǔ)。此外，為了正確反映巨大血小板患者的血小板數(shù)量，我們應(yīng)使用人工計數(shù)法而不是細胞自動計數(shù)儀法來計數(shù)血小板的數(shù)量。
　　 第二章 MYH9-RD家系MYH9基因

5、突變檢測與分析
　　 目的：探討和分析-MYH9-RD家系非肌球蛋白重鏈9(MYH9)基因的突變情況。
　　 方法：簽定知情同意書后，采集患者和家系成員的外周血。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序的方法對15例家系患者MYH9基因的全部40個外顯子和側(cè)翼區(qū)進行突變檢測和分析，選擇家系正常個體為對照。測序結(jié)果通過DNAMAN軟件與Genebank中的正常MYH9基因序列進行比對。
　　 結(jié)果：家系患者MYH9基因的所有外顯

6、子與側(cè)翼區(qū)均未檢測到致病性突變，只有25號和18號外顯子各有一同義突變。
　　 結(jié)論：本家系可能存在新的基因突變類型或此類疾病的另一個新的致病基因或其它原因，其臨床表型復(fù)雜多樣可能與此有關(guān)。對該家系的深入研究將對進一步闡明該遺傳性疾病形成的分子機制具有重要的意義。
　　 第三章 MYH9-RD家系非肌性肌球蛋白重鏈Ⅱ A在中性粒細胞中的定位與表達
　　 目的：觀察該MYH9-RD家系患者非肌性肌球蛋白重鏈Ⅱ A(

7、nonmuscle myosin heavy chain-ⅡA，NMMHC-Ⅱ A)在中性粒細胞中的定位和表達，闡明MYH9-RD中性粒細胞包涵體的性質(zhì)和形成特點，以探討MYH9-RD的致病機制。
　　 方法：分離MYH9-RD患者和正常對照者外周血中性粒細胞。應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)，觀察MYH9-RD患者與正常對照者NMMHC-ⅡA在胞漿中的分布情況；應(yīng)用Westernblot技術(shù)分析MHY9-RD中患者和正常對照者之間NMMH

8、C-Ⅱ A蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果：MYH9-RD患者中性粒細胞胞漿中存在“橢圓形及梭形”包涵體的形態(tài)和輪廓，與瑞特姬姆薩染色顯示的包涵體形狀、大小基本一致，但更為清晰；而正常對照中性粒細胞胞漿中的熒光呈彌散分布，無叢集現(xiàn)象，未見包涵體；Westernblot結(jié)果顯示患者NMMHC-Ⅱ A含量較正常對照降低。
　　 結(jié)論：免疫熒光技術(shù)和Westernblot技術(shù)均顯示患者和正常人之間MYH9基因編碼蛋白NMMHC-Ⅱ

9、A在中性粒細胞中的表達和分布存在異常，提示NMMHC-Ⅱ A的顯性負性效應(yīng)導(dǎo)致了中性粒細胞包涵體的產(chǎn)生，表明本家系MYH9-RD患者中性粒細胞包涵體的主要構(gòu)成成份和性質(zhì)是非肌性肌球蛋白Ⅱ A，NMMHC-Ⅱ A是本家系致病機理的一個重要方面。雖然本家MYH9基因40個外顯子和側(cè)翼區(qū)未檢測到致病性突變，但本家系的致病基因有可能還是由MYH9基因異常導(dǎo)致的。同時，免疫熒光染色技術(shù)較瑞特姬姆薩染色法更敏感，特異性更強，對診斷MYH9-RD具有

10、重要的意義。
　　 第四章 MYH9-RD家系血小板中NMMHC-Ⅱ A和膜糖蛋白的檢測與分析
　　 目的：通過分析該MYH9-RD家系患者血小板膜糖蛋白表達差異和NMMHC-ⅡA在血小板中的分布特點，來進一步探討該家系血小板與MYH9-RD之間的致病機理。
　　 方法：采取家系患者和正常對照者的外周血，并分離血小板。應(yīng)用流式細胞術(shù)對MYH9-RD家系患者與正常個體之間的血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa(CD41/

11、61)、GPⅠ a(CD49b)、GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ(CD42a)GPⅠ b(CD42b)和GPⅣ(CD36)進行檢測，運用免疫熒光方法觀察NMMHC-ⅡA在正常人和患者之間的分布。
　　 結(jié)果：家系患者血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa(CD41/61)、GPⅠa(CD49b)、GPⅠ b/Ⅸ/Ⅴ(CD42a)GPⅠ b(CD42b)和GPⅣ(CD36)檢測結(jié)果正常，血小板膜糖蛋白表達量在家系患者和正常對照者之間，無統(tǒng)計學(xué)意義(P

12、>0.05)；但家系患者個體之間血小板的活化水平不同。免疫熒光結(jié)果顯示患者血小板中NMMHC-Ⅱ A在血小板中央?yún)^(qū)染色分布均勻，但是在血小板的外圍染色較密集；而正常人結(jié)果顯示NMMHC-ⅡA在血小板中是呈均勻分布的。
　　 結(jié)論：家系患者中血小板中NMMHC-ⅡA蛋白分布存在異常，提示家系患者巨大血小板的形成可能與NMMHC-Ⅱ A異常分布有關(guān)；雖然家系患者和正常個體之間的血小板膜糖蛋白表達沒有差異，但是家系患者之間血小板的活化