中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體MLPA診斷試劑盒初步研發(fā).pdf

1、神經(jīng)中樞系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）感染是臨床上常見疾病，由于其高致死率和產(chǎn)生嚴重后遺癥而倍受關注?？焖倜鞔_診斷是應對臨床治療非常關鍵，但是，現(xiàn)有診斷技術不能達到此目的。
　　本課題先總結(jié)了常見 CNS感染病原物種類，接著針對神經(jīng)外科手術感染(Intracranial infection)17種常見細菌設計了一套MLPA探針。由于構(gòu)建MLPA探針所需質(zhì)粒等關鍵試劑一直被荷蘭 MRC-Holland公

2、司壟斷，除了利用合成方法制備短探針外，我們不得不逐步探索一套 MLPA長探針制備方法。首先我們使用M13噬菌體克隆了17種致病細菌的MLPA長探針，并把所得的M13噬菌體載體均通過了測序驗證以保證這17個克隆載體均能夠用于制備 MLPA探針，再通過 Bsm I和EcoR V雙酶切法制備獲得長探針。該種探針制備方法使MLPA探針擴大化生產(chǎn)變得簡單、快速，可以推廣到其他MLPA探針大量制備工藝中。
　　在探針驗證方面，我們克隆了17個

3、陽性標準品質(zhì)粒，這些質(zhì)粒各含有短探針和長探針DNA序列，經(jīng)過單靶點和多靶點PCR擴增、ABI3500毛細電泳測試分析，證明我們制備的MLPA探針具備非常高的靈敏度和靶向性。課題預計僅用1 ml M13噬菌體衍生載體液體制備的探針便可滿足10萬次左右的MLPA反應，凸顯了MLPA的廉價性，也說明了MLPA診斷技術用于CNS感染病原體診斷有市場潛力。課題也做了探針質(zhì)量控制分析，為進一步將探針研發(fā)成可以商品化的診斷試劑盒奠定了基礎。總之，所設

4、計的MLPA試劑盒具有靈敏度高、快速、操作簡單、便宜等優(yōu)點，對CNS感染病原菌診斷具有重要醫(yī)用潛力。
　　本課題也同時設計了針對腦炎（Encephalitis）、腦膜炎（Cephalomeningitis）等非神經(jīng)外科手術（Craniotomy）后感染的病原體 MLPA診斷探針。首先，為體現(xiàn)探針的可靠性和科學性我們爭取每一個靶位點找到相關的研究文獻數(shù)據(jù)，其次，聯(lián)合使用Raw probe、MLPA Probe Verificatio