抗癲癇肽抗癲癇作用靶位篩選及功能探討.pdf

1、癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，病程長，致殘率高，易反復(fù)。資料顯示，我國癲癇患病率為7‰，年發(fā)病率為28.8/10萬，目前我國約有900萬癲癇病人，占全世界患者的1/5～1/6，同時每年新增加病人數(shù)約40萬。由于癲癇患者需要長期服用抗癲癇藥物（多數(shù)達3年以上），因此極易產(chǎn)生耐藥性；同時由于抗癲癇藥物較大的毒副作用，如胃腸道刺激、肝功能損害、記憶和認知功能減退、骨損害及致癇作用等，也限制了其臨床應(yīng)用和療效。約有25％～30％的患者轉(zhuǎn)為難治

2、性癲癇。因其直接威脅病人的身心健康，影響患者和家庭成員的生活質(zhì)量并加重經(jīng)濟負擔，所以尋求一種更安全有效的治療癲癇的藥物及方法，已成為醫(yī)學科學研究的熱點。 抗癲癇肽（anti-epilepsy peptide，AEP）是從東亞鉗蝎粗毒液中分離的一種具有生物學活性的多肽，研究證實它有良好的抗癲癇作用，具有作用強、用量小、毒性低的特點。但其治療癲癇的作用機制尚不明確。為進一步探討AEP抗癲癇的作用機制，我們通過基因重組技術(shù)分別構(gòu)建原核

3、和真核表達載體，誘導(dǎo)表達重組蛋白，通過復(fù)制海人酸癲癇大鼠模型，制備腦勻漿，采用pull-down實驗檢測與AEP相互作用的分子，利用生物信息學方法分析靶蛋白，初步探討AEP的抗癲癇作用機制。為研制新型的抗癲癇藥物提供理論依據(jù)，也為中藥的作用機理研究提供新的思路和方法。我們的研究結(jié)果可以歸納為以下幾點： 1.成功構(gòu)建了含有AEP基因片段的測序載體PUC18-T-AEP和原核表達載體pGEX-4T-1-AEP；將重組表達載體pGEX

4、-4T-1-AEP轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)大腸桿菌細胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了高效表達，經(jīng)Western blot驗證，證實為融合蛋白；對表達菌進行超聲裂解，發(fā)現(xiàn)融合蛋白以包涵體形式存在；通過對包涵體蛋白進行洗滌、尿素變性和透析復(fù)性后，用谷胱甘肽瓊脂糖珠進行了純化。 2.復(fù)制了海人酸癲癇大鼠模型，制備腦勻漿蛋白，采用GST pull-down實驗篩選AEP的相互作用蛋白，但經(jīng)過多次嘗試后未能達到預(yù)期目的，考慮與AEP分子量

5、較小，而與其融合的分子伴侶GST較大，掩蓋了其有效結(jié)合位點有關(guān)。 3.通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了AEP二串體畢赤酵母表達載體pPIC9K-AEP2-His，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌SMD1168感受態(tài)細胞，采用G418篩選出高拷貝的轉(zhuǎn)化子，用pPIC9K載體自帶通用引物進行PCR反應(yīng)，鑒定AEP2-His基因整合于染色體基因組中后，甲醇誘導(dǎo)在畢赤酵母中獲得表達，用抗His單克隆抗體進行Western blot驗證；用Ni-chelati

6、ng Sepharose FF柱純化AEP2-His蛋白，純化后用BCA蛋白定量試劑盒定量并進行了電泳鑒定。 4.復(fù)制海人酸癲癇大鼠模型，并取海馬組織，采用膜蛋白提取試劑盒提取海馬組織細胞膜蛋白，與結(jié)合有AEP2-His蛋白的Ni-chelating Sepharose FF柱共孵育，通過His pull-down篩選AEP的相互作用分子，同時設(shè)對照。結(jié)果提示：與對照組相比，AEP2-His蛋白孵育組有4條比較明顯的蛋白條帶，將