CIDEC在人脂肪細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式的轉(zhuǎn)變，肥胖（obesity）已成為當(dāng)前世界性的健康問題，是誘發(fā)糖尿病、心腦血管疾病等多種代謝相關(guān)疾病的重要危險因素，其與吸煙、艾滋病并稱為人類健康的三大殺手。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞的分化與肥胖的發(fā)生有著密切的關(guān)系。因此，研究脂肪細(xì)胞的分化及其機(jī)制，對于預(yù)防肥胖的發(fā)生，治療肥胖及相關(guān)疾病具有重要意義。
　　CIDE（celldeath-inducingDFF45-likeeffectors）家族是20

2、世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一組能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的新基因。CIDE家族主要包括CIDEA、CIDEB和CIDEC（在小鼠稱為FSP27）。最近研究發(fā)現(xiàn)CIDE家族成員與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。CIDEA、CIDEB和FSP27敲除小鼠，均能抵制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。其中FSP27是小鼠脂肪特異性蛋白，僅在成熟的脂肪細(xì)胞中表達(dá)，與脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)，并且具有抑制脂肪分解促進(jìn)脂肪儲積的作用。CIDEC，作為FSP27的人類同源物，其在人體內(nèi)功能及機(jī)制尚不明確。

3、因此本課題將著重研究CIDEC在人類脂肪細(xì)胞分化中的作用，期望為今后治療肥胖提供新的靶點(diǎn)。
　　【目的】
　　1、研究CIDEC的表達(dá)與脂肪細(xì)胞分化的關(guān)系；2、研究CIDEC的亞細(xì)胞定位；3、研究下調(diào)CIDEC表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響及機(jī)制。
　　【方法】
　　1、利用免疫組織化學(xué)、Real-timePCR和Westernblot方法檢測CIDEC在不同發(fā)育階段的人胚胎脂肪組織以及不同分化程度脂肪腫瘤組織中的表達(dá)

4、變化；2、構(gòu)建CIDEC與熒光蛋白融合表達(dá)的質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，以確定CIDEC蛋白的亞細(xì)胞定位。3、體外原代培養(yǎng)人前脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，檢測不同分化階段CIDEC的表達(dá)水平。4、利用慢病毒siRNA沉默CIDEC的表達(dá)，以研究下調(diào)CIDEC表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響，并分析其機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1、CIDEC的表達(dá)水平與脂肪細(xì)胞的分化相關(guān)
　　我們采用免疫組織化學(xué)、Real-timePCR和

5、Westernblot方法比較了3例不同發(fā)育階段的胎兒脂肪組織中CIDEC的表達(dá)情況，同時檢測調(diào)控脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵分子PPARγ的變化。結(jié)果顯示，無論mRNA還是蛋白水平，CIDEC均呈現(xiàn)隨著分化成熟逐漸增高的趨勢，并且與PPARγ的表達(dá)趨勢完全一致。對30例人體正常脂肪組織和45例不同分化程度的脂肪腫瘤組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CIDEC隨著脂肪細(xì)胞分化程度降低而表達(dá)降低。采用Real-timePCR和Westernblot方法

6、的研究結(jié)果顯示，同正常脂肪組織相比，脂肪瘤中CIDEC的表達(dá)變化不顯著，而分化好的脂肪肉瘤、黏液型脂肪肉瘤及去分化脂肪肉瘤中CIDEC的表達(dá)均顯著降低（n=5,*p<0.05）。此外，通過體外實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)人前脂肪細(xì)胞，并誘導(dǎo)成為成熟脂肪細(xì)胞，隨著脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成熟，CIDEC和PPARγ的表達(dá)水平同誘導(dǎo)前相比急劇升高（*p<0.05），同脂肪分化標(biāo)志分子FABP4變化趨勢一致。以上體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CIDEC在脂肪細(xì)胞分化過程中

7、發(fā)揮重要作用。
　　2、CIDEC蛋白主要定位于脂滴表面，與線粒體沒有共定位
　　我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDEC和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDEC轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。以GFP-adipophilin作為脂滴的標(biāo)志物；Bodipy493/503作為中性脂肪染料；MitoTrackerRedCMXRos作為線粒體染料；Hoechst33258作為細(xì)胞核染料。結(jié)果顯示

8、：CIDEC分布于脂滴周圍，與adipophilin共定位，說明CIDEC是一個定位于脂滴表面的蛋白；同時我們發(fā)現(xiàn)CIDEC與線粒體不存在共定位。
　　3、下調(diào)CIDEC的表達(dá)水平，脂肪細(xì)胞的分化受到抑制
　　我們首先構(gòu)建了攜帶針對CIDEC的高效siRNA的慢病毒，將原代培養(yǎng)的人前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化以前感染此慢病毒，觀察下調(diào)CIDEC的表達(dá)對脂肪細(xì)胞分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CIDEC表達(dá)水平后，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴體積明顯減小

9、，脂肪含量也顯著降低，失去了成熟脂肪細(xì)胞的表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CIDEC低表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量降低，而培養(yǎng)液中甘油的含量卻顯著增高。分子水平研究發(fā)現(xiàn)，成熟脂滴標(biāo)志分子perilipin以及脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志分子FABP4表達(dá)水平顯著降低。以上實(shí)驗(yàn)說明，下調(diào)CIDEC的表達(dá)使甘油三酯合成降低，分解增強(qiáng)，此外脂滴的成熟也受到影響，從而抑制了脂肪細(xì)胞的分化。
　　【結(jié)論】
　　本研究發(fā)現(xiàn)CIDEC是一個脂滴表面蛋白，CIDE