MORC2在肝細胞脂肪變性中的作用與機制研究.pdf

1、目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)由于其廣大的患病人群以及進展為慢性肝功能衰竭和肝癌等終末期肝病的可能性，已被人們高度關注。對于NAFLD的發(fā)病機制，目前仍未完全闡明，較為公認的是“二次打擊”理論:第一次打擊主要指肝細胞發(fā)生脂肪變性，使肝細胞更容易受到細胞內外各種損傷因子的攻擊;第二次打擊是肝細胞內蓄積過多的脂類產生脂毒性，造成膜結構、DNA與細胞器等損傷

2、，最終使肝細胞死亡。
　　肝臟脂肪代謝紊亂是NAFLD發(fā)生的病理基礎。在肝細胞脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持中，核轉錄因子在其中發(fā)揮重要作用。核轉錄因子MORC2（Microrchidia family CW-typezinc finger2，也稱ZCWCC1）蛋白由970個氨基酸殘基組成，其中的核定位序列可使成熟的MORC2蛋白主要定位于胞核，為其調控基因轉錄提供了細胞定位的前提;序列中鋅指結構有利于MORC2結合DNA片段，發(fā)揮轉錄調控作用

3、。另外，MORC2蛋白含有特征性GHKL-ATPase保守結構域，可參與異染色質形成，通過封閉基因轉錄起始部位達到使基因沉默的作用。MORC2也可與組蛋白去乙?；?(HDAC4)形成蛋白復合物，通過表觀遺傳的方式發(fā)揮負性轉錄調控作用?，F已鑒定出了第一個直接受MORC2負性調控的下游基因CAIX，人們對MORC2作為抑制性核轉錄因子的研究將繼續(xù)深入。
　　少量表達于胞漿中的MORC2也可發(fā)揮與調控轉錄的功能無關的效應:在前脂肪細胞

4、向脂肪細胞分化時，胞質中的MORC2含量上升，且可與ATP-檸檬酸裂解酶相互作用，促進后者的活化。ATP-檸檬酸裂解酶是催化乙酰輔酶A形成的重要分子，而后者則是糖、脂等能量代謝中的核心。由于前脂肪細胞在分化過程中發(fā)生了成脂基因激活、甘油三酯(triglyceride，TG)蓄積等與肝細胞脂肪變性類似的分子事件，故上述發(fā)現為本課題的研究提供了至關重要的線索和依據。
　　為此，我們嘗試研究MORC2在肝細胞脂肪變性過程中是否發(fā)生含量變

5、化、是否通過調控脂代謝相關基因進而參與了脂肪代謝穩(wěn)態(tài)失衡和脂肪變性的發(fā)生。本研究為進一步闡明“第一次打擊”及NAFLD的發(fā)病機理提供了新的實驗依據及思路。
　　方法：
　　1.構建永生化人肝細胞株L02（以下簡稱L02肝細胞）的脂肪變性模型，并使用ORO染色及細胞TG含量檢測對模型進行鑒定;
　　2.免疫熒光及Western Blotting技術檢測MORC2在L02肝細胞脂肪變性誘導過程中的核漿蛋白水平變化;

6、　　3.檢測MORC2在L02肝細胞脂肪變性過程中的蛋白合成與降解水平
　　3.1.qRT-PCR檢測L02肝細胞脂肪變性誘導前后morc2的mRNA水平變化;
　　3.2.UbiPred網站及UbiProber軟件預測MORC2蛋白氨基酸序列上可能的泛素化修飾位點;
　　3.3.Western Blotting檢測增強或抑制泛素-蛋白酶體途徑后的MORC2蛋白水平;
　　4.構建慢病毒并轉染L02肝細胞，使其穩(wěn)

7、定過表達MORC2;并使用WestemBlotting對過表達效果進行鑒定;
　　5.ORO染色及TG含量測定比較過表達MORC2前后L02肝細胞的脂肪變性程度;
　　6.基因表達譜芯片篩選MORC2可能影響的脂代謝相關基因或通路;
　　7.Western Blotting檢測L02肝細胞中p53蛋白水平在過表達MORC2前后的變化;
　　8.pCMV6-XL5-p53質粒轉染L02肝細胞以過表達p53，并使用W

8、estern Blotting進行效果鑒定;
　　9.ORO染色及TG含量測定觀察MORC2過表達后，再過表達p53時，L02肝細胞的脂肪變性程度;
　　10.使用StepOne軟件、SPSS18.0軟件對數據進行分析。
　　結果：
　　1.L02肝細胞脂肪變性模型的建立與鑒定
　　ORO染色及TG含量測定可見對照組細胞脂肪含量極少，而脂肪變性誘導組細胞脂肪蓄積程度明顯，且具有時間依賴性;
　　2.免

9、疫熒光及Western Blotting檢測MORC2在L02肝細胞脂肪變性誘導過程中的蛋白水平變化
　　MORC2蛋白主要表達在L02肝細胞核內，胞漿表達少，在脂肪變性誘導的前12h，MORC2的核、漿含量均無顯著變化;在誘導12h后，胞核中MORC2的含量出現明顯下降，而胞漿中的含量無明顯變化;
　　3.MORC2在L02肝細胞脂肪變性過程中的蛋白水平下降與泛素-蛋白酶體途徑有關
　　3.1.qRT-PCR檢測中發(fā)

10、現，相比于對照組，脂肪變性誘導組細胞的morc2 mRNA水平并無明顯變化;
　　3.2.UbiPred網站UbiProber軟件預測結果顯示，在MORC2的氨基酸序列中存在9個可能性在80％以上的泛素化修飾位點;
　　3.3.加用NEM提取蛋白可使胞核中MORC2蛋白含量降低，但胞漿中MORC2無明顯變化;
　　3.4.使用MG-132抑制蛋白酶體可解除MORC2在L02脂肪變性過程中的下降趨勢;
　　4.穩(wěn)定

11、過表達MORC2的L02肝細胞建立與鑒定
　　4.1.將MORC2過表達載體用ECoRV進行酶切鑒定、測序及比對結果顯示質粒序列無誤;
　　4.2.Western Blotting檢測中，可見L02-MORC2組核漿蛋白及總蛋白中的MORC2蛋白含量均較L02-WT組及L02-ctrl組明顯上調;
　　5.過表達MORC2可減輕L02肝細胞的脂肪變性
　　ORO染色及TG含量測定結果顯示，脂肪變性誘導后，L02-

12、MORC2組細胞的脂肪蓄積程度較L02-WT組及L02-ctrl組明顯減輕;
　　6.篩選MORC2可能影響的脂代謝相關基因或通路
　　熱圖結果顯示，在L02-MORC2組與L02-ctrl組之間的基因表達譜發(fā)生了明顯變化;GO分析與Pathway分析結果顯示，MORC2的功能主要與結合蛋白、核酸等大分子有關，也可負性調控多種生物學過程，MORC2可能調控的通路包括與脂肪代謝密切相關的p53通路;
　　7.L02肝細胞

13、中p53分子蛋白水平在過表達MORC2后降低
　　在對P53蛋白的Western Blotting檢測中，當L02肝細胞過表達MORC2后，P53蛋白水平發(fā)生了明顯下降;
　　8.過表達p53的效果鑒定
　　Western Blotting檢測顯示:在轉染p53過表達質粒后，P53的蛋白水平較轉染對照質粒時明顯升高，且L02-MORC2組中p53的表達水平比L02-WT組及L02-ctrl組略低。
　　9.ORO

14、染色及細胞TG含量測定均顯示過表達p53可部分解除MORC2減輕L02肝細胞脂肪變性的效應
　　由ORO及細胞TG含量測定可見:在轉染p53過表達質粒或對照質粒時，L02-MORC2組細胞的脂肪蓄積程度均較L02-WT與L02-ctrl組減輕。但在過表達p53后，MORC2的這種減輕L02肝細胞脂肪變性的效應得到了一定程度的削弱。
　　結論：
　　1.在L02肝細胞脂肪變性過程中，胞核中的MORC2蛋白含量發(fā)生了顯著降

15、低;而MORC2的蛋白合成水平未發(fā)生明顯變化，此時MORC2主要在泛素-蛋白酶體途徑中進行降解;
　　2.過表達MORC2可減輕L02肝細胞在脂肪變性誘導后的細胞內TG蓄積，提示MORC2蛋白可在脂肪變性時對L02肝細胞發(fā)揮保護作用;
　　3.L02肝細胞中p53通路水平在過表達MORC2后發(fā)生了下調，p53蛋白水平降低;且過表達p53后，過表達MORC2減輕L02肝細胞脂肪變性的效應得到了削弱，提示MORC2對脂肪變性的保