IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：IL-23表達(dá)質(zhì)粒和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建
　　目的：小鼠IL-23融合基因片段的克隆及hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。
　　方法：取小鼠hepa1-6細(xì)胞提取總RNA,通過RT-PCR克隆p19基因的編碼區(qū)和p40基因編碼區(qū)的成熟區(qū)；采用重疊延伸PCR的方法，通過編碼一段柔性肽段(Gly4Ser)3的DNA序列連接p19片段和p40片段，構(gòu)建小鼠IL-23單鏈融合基因，添加酶切位點(diǎn)，并將其克隆至 pRRL-Venus慢

2、病毒載體中。通過包裝慢病毒感染hepa1-6細(xì)胞，再通過流式分選的方法篩得可以穩(wěn)定表達(dá)IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　結(jié)果：DNA測(cè)序結(jié)果表明：小鼠IL-23融合基因中p19、linker及p40的連接順序、方向及翻譯成氨基酸序列完全正確。
　　結(jié)論：成功克隆小鼠IL-23單鏈融合基因并構(gòu)建其慢病毒質(zhì)粒。成功構(gòu)建可以穩(wěn)定表達(dá)IL-23的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及其機(jī)

3、制奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分：IL-23對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為的影響
　　目的：體外檢測(cè)IL-23對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。
　　方法：通過一系列體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè) IL-23對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。包括：采用MTT實(shí)驗(yàn)、Ki-67染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生長、增殖的影響；通過Annexin V和7AAD的流式染色檢測(cè)IL-23對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響；通過細(xì)胞周期的流式染色檢

4、測(cè)IL-23對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響；通過劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-23對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移能力的影響。
　　結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)和Ki-67染色結(jié)果顯示IL-23促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；細(xì)胞凋亡的染色結(jié)果表明IL-23不影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期的結(jié)果表明IL-23促進(jìn)肝癌細(xì)胞維持在S期和G2期；劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)提示IL-23可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)揭示IL-23可以促進(jìn)肝癌

5、細(xì)胞的生長、增殖和遷移，并且可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞維持在S期和G2期，但是不影響肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及機(jī)制的研究
　　目的：利用小鼠肝癌動(dòng)物模型探究IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：(1)構(gòu)建肝癌模型：(a.)取對(duì)數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞用 PBS制成單細(xì)胞懸液(5×105/ml)，每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/2 ml PBS，利用高

6、壓水流動(dòng)力學(xué)的注射方法在5-8s內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3周后處死小鼠，取出小鼠肝臟，計(jì)數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)；(b.)提前一周給小鼠喝含抗生素(80000U/250ml)的酸性水。取對(duì)數(shù)生長期的hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞用PBS制成單細(xì)胞懸液(4×107/ml)，每只小鼠注射的細(xì)胞量為1×106/25μl PBS，利用手術(shù)的方法，在超凈工作臺(tái)中，將小鼠腹部剖開一小口，擠出肝臟一葉，用胰島素注射器吸取細(xì)胞緩慢的注射入暴露的肝臟中，再將小

7、鼠傷口縫合。2周后處死小鼠，取出小鼠肝臟，測(cè)量并計(jì)算小鼠腫瘤體積；(c.)取14天大的C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射 DEN(25mg/kg)，于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)8-10個(gè)月，從第5個(gè)月開始，每兩個(gè)月采用高壓水流動(dòng)力學(xué)的方法注射對(duì)照及IL-23微環(huán)質(zhì)粒，8個(gè)月后處死小鼠，計(jì)數(shù)肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)并測(cè)量腫瘤體積。
　　(2)通過流式染色檢測(cè)荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中淋巴細(xì)胞表面CD3、CD4、C

8、D8、CD62L、CD44、CD25、CD127、CD11b、Gr1等marker的陽性率；胞內(nèi)染色檢測(cè)荷瘤鼠及HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞后1周的非荷瘤鼠脾臟和肝臟中 CD4+ T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A以及CD8+ T細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-17A。利用IL-17A敲基因小鼠重復(fù)HGT注射hepa1-6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建肝癌模型的實(shí)驗(yàn)確定IL-17A在IL-23介導(dǎo)的促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中的作用

9、。采用CBA染色探究IL-23對(duì)外周血中細(xì)胞因子的影響。
　　結(jié)果：通過不同方法構(gòu)建的肝癌模型表明IL-23在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展中具有促進(jìn)作用。流式染色結(jié)果表明在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展后期 IL-23影響了脾臟和肝臟中MDSC、Treg等抑制性細(xì)胞的所占的比例及IFN-γ、TNF-α和IL-17A的分泌。在肝細(xì)胞肝癌發(fā)展早期流式染色結(jié)果表示 IL-23影響了肝臟中 CD4+效應(yīng) T細(xì)胞和CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的比例以及脾臟和肝臟中IL-17A的表