二氫楊梅素通過(guò)AMPK-SIRT1信號(hào)通路改善肝細(xì)胞脂肪變性的作用及機(jī)制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝臟脂肪浸潤(rùn)、單純性脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化和/或肝硬化以及肝癌為特征的臨床綜合征。近年來(lái)NAFLD的發(fā)病率越來(lái)越高，且越來(lái)越年輕化，全世界大約有15％～30％的成年人患有NAFLD。雖然大部分的非酒精性單純性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver, NAFL)患者早期并沒(méi)有出現(xiàn)肝功能損傷的情況，但是大約有1/5

2、的NAFL可能會(huì)繼續(xù)發(fā)展成非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化甚至肝癌。目前尚未發(fā)現(xiàn)防治NAFLD的理想措施，因此，NAFLD已發(fā)展為嚴(yán)重危害公眾健康的一大問(wèn)題。
　　NAFLD的發(fā)病原因和機(jī)理還有爭(zhēng)議，目前“多重打擊”學(xué)說(shuō)占主導(dǎo)地位，這一學(xué)說(shuō)認(rèn)為:胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)和高濃度游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)作為初

3、次打擊使得肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，從而對(duì)內(nèi)、外源性損害因素的敏感性增加;第二次打擊主要是活性氧(Reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及相關(guān)事件，引起肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)和纖維化;第三次打擊主要是氧化應(yīng)激持續(xù)存在，炎癥-肝細(xì)胞壞死惡性循環(huán)，導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌。由此可見(jiàn)，過(guò)量脂肪蓄積是NAFLD發(fā)生的必要條件，氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)展的關(guān)鍵。近年來(lái)應(yīng)用減肥藥、胰島素增敏劑、降脂藥或抗氧化劑（

4、如維生素E和C）等治療措施對(duì)NAFLD開(kāi)展了大量的臨床研究，但尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)NAFLD療效明確且無(wú)明顯副作用的治療藥物。一些黃酮類(lèi)的植物提取物或植物化學(xué)成分具有良好的抗氧化、改善胰島素抵抗和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用，被認(rèn)為可能對(duì)NAFLD具有防治效果。二氫楊梅素(Dihydromyricetin，DHM)是存在于藤茶中含量很高的一種天然黃酮類(lèi)植物化合物，已有報(bào)道表明其具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、保護(hù)高脂對(duì)肝臟損傷、改善脂肪肝等作用，但其作用機(jī)制還不是很清楚

5、。在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，調(diào)控脂質(zhì)合成的關(guān)鍵基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(Sterol regulatoryelement binding protein-1c，SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)的表達(dá)明顯增加。DHM能否下調(diào)脂質(zhì)合成有關(guān)基因的表達(dá)與活性而改善肝臟脂肪變性還有待進(jìn)一步研究。
　　本實(shí)驗(yàn)室

6、前期開(kāi)展DHM對(duì)NAFLD人群干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)DHM能夠改善NAFLD患者的脂代謝及炎癥反應(yīng)，而在體外研究發(fā)現(xiàn)DHM也可以通過(guò)激活骨骼肌細(xì)胞AMPK信號(hào)通路改善其胰島素抵抗。有文獻(xiàn)報(bào)道，沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silence information regulator1，SIRT1)和/或腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的激活能夠改善肝細(xì)胞脂肪變性。因

7、此，本研究提出如下假說(shuō):DHM可能通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂代謝、減少肝細(xì)胞的脂肪蓄積，改善肝細(xì)胞脂肪變性，成為防治NAFLD的理想植物化合物。本研究深入探討DHM改善肝細(xì)胞脂肪變性的可能分子機(jī)制，為NAFLD的防治及有效藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本課題使用0.2mmol/L棕櫚酸(Palmitic acid,PA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24h建立肝細(xì)胞脂肪變性模型，繼而用不同濃度DHM(0、5、10、20μ

8、mol/L)處理24h，首先用油紅O染色法、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量測(cè)定法觀察DHM對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積程度的影響;然后用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1、AMPK、SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)SIRT1、SREBP-1c、FAS、ACC mRNA水平;最后，結(jié)合SIRT1和AMPK抑制劑、siRNA干擾，進(jìn)一步探究AMPK/SIRT1信號(hào)通路在DHM改善肝細(xì)胞脂肪變性中的作用。

9、　　主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)PA處理HepG2細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積增加，不同濃度的DHM處理后HepG2細(xì)胞中TG的含量和脂滴蓄積程度減少，表明DHM具有顯著改善HepG2細(xì)胞脂肪蓄積的作用。
　　(2)DHM處理脂肪變性的HepG2細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著降低，提示DHM通過(guò)下調(diào)HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)與活性，抑制細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成，

10、改善肝細(xì)胞脂肪變性。
　　(3)PA處理HepG2細(xì)胞后，SIRT1蛋白和mRNA水平以及AMPK尤其是磷酸化的AMPK蛋白水平顯著下降，而DHM處理后磷酸化的AMPK和SIRT1蛋白水平明顯增加，說(shuō)明DHM能夠促進(jìn)AMPK的磷酸化，上調(diào)AMPK的活性，同時(shí)上調(diào)SIRT1的表達(dá)而改善肝細(xì)胞脂肪蓄積。使用AMPK抑制劑CC抑制AMPK活性、SIRT1抑制劑EX527抑制SIRT1活性或siRNA沉默干擾SIRT1表達(dá)后再通過(guò)DHM處