miR-24在人骨髓間質干細胞成骨分化中的作用機制研究.pdf

1、背景和目的：miRNA(microRNA)是一些長度很短的非編碼RNA，通過降低靶基因的穩(wěn)定性或抑制其翻譯水平來影響細胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明miRNA對于成骨起到重要作用。關于其在成骨發(fā)生發(fā)展中所起的作用，已經日益成為研究的熱點。前期課題已經檢測DISH患者黃韌帶中miR-24表達較正常人黃韌帶水平下降，并預測其靶基因為Tcf-1。本課題研究miR-24在BMP-2誘導下人骨髓基質細胞(hMSCs)向成骨細胞分化中的作用，

2、驗證其靶基因Tcf-1，闡明miR-24促進人骨髓間充質干細胞骨化機制。
　　方法：體外分離人骨髓間充質細胞，在體外擴增傳代培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特點，流式細胞儀檢測培養(yǎng)第六代的、已純化的骨髓間充質干細胞。BMP-2誘導hMSCs成骨分化，Northernblot技術檢測miRNA-24在此過程中的表達模式。設置BMP-2(+)與BMP-2(-)對照組，miR-24、anti-miR-24與miR-NC分別脂質體轉染人骨髓基質細胞(hM

3、SCs)。ALP活性檢測試劑盒檢測ALP活性，加入經典成骨誘導液后用茜素紅染色檢測鈣結節(jié)。Westernblot檢測不同時間Tcf-1蛋白和Runx2蛋白變化，實時定量PCR檢測Tcf-1mRNA表達的變化。構建野生型、突變型、缺失型Tcf-1熒光素酶報告基因載體，分別與miR-24或miR-NC共同轉染hMSCs，采用雙熒光素酶報告基因檢測法驗證miR-24對靶基因Tcf-1的直接調控作用。
　　結果：經過分離、培養(yǎng)的人骨髓間充

4、質干細胞，經多次傳代后，細胞逐漸純化，并且細胞初期多以集落形式增長，第6代后細胞曾形態(tài)均一的紡錘形，分布均勻。流式細胞儀檢測符合人骨髓間充質干細胞的特征。隨著BMP-2誘導分化時間的延長，miR-24表達逐漸降低。在BMP-2誘導下，ALP活性增加，轉染miR-24過表達降低ALP活性。轉染miR-24后基質鈣結節(jié)減少。RT-PCR顯示轉染miR-24后Tcf-1mRNA無明顯改變。Western印跡顯示轉染miR-24后Tcf-1蛋白

5、及Runx2蛋白表達下降。miR-24與野生型、突變型熒光素酶報告基因載體共轉染后熒光素酶活性顯著下降(p<0.05)，而轉染突變型及缺失型熒光素酶活性則無明顯變化。
　　結論：1.分離、培養(yǎng)的細胞形態(tài)正常，符合人骨髓間充質干細胞的特征。2.在BMP-2誘導下，人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，miR-24隨著誘導時間的延長逐漸下降。3.在BMP-2誘導下，轉染miR-24后，Tcf-1蛋白與Runx2蛋白水平下降，Tcf-1mR