絲素蛋白支架在尿道狹窄重建中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分新西蘭大白兔尿道狹窄模型的建立
　　 目的：探索新西蘭大白兔尿道狹窄模型建立的方法。
　　 方法：將12只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分成兩組，每組6只，平均體重2.84±0.15kg。A組為正常對照組。B組為尿道狹窄組：在戊巴比妥鈉溶液靜脈注射麻醉后，剝除1.0cm左右尿道粘膜，逐層縫合后留置F-8橡皮導(dǎo)尿管并固定。所有操作均在10倍光鏡下，運(yùn)用顯微器械完成。術(shù)后觀察兩組實(shí)驗(yàn)兔，在飼養(yǎng)2個月時分別行順行膀胱尿道造影、尿

2、道測壓和組織細(xì)胞學(xué)檢測。術(shù)中和術(shù)后一周腹腔注射抗生素以預(yù)防感染。
　　 結(jié)果：B組1只新西蘭大白兔在麻醉后腹腔注射抗生素時出現(xiàn)休克表現(xiàn)，搶救無效死亡。在補(bǔ)充一只尿道狹窄組大白兔后，兩組實(shí)驗(yàn)兔均順利完成實(shí)驗(yàn)。術(shù)后1周左右，留置導(dǎo)尿管自行脫落。觀察發(fā)現(xiàn)B組術(shù)后兩個月后明顯較第一組焦躁。
　　 (1)膀胱尿道造影：術(shù)后兩個月順行膀胱尿道造影尿道狹窄組較對照組有明顯狹窄，尿道管腔變細(xì)，粘膜粗糙不連續(xù)。
　　 (2)尿道測

3、壓：A組(正常對照組)手術(shù)部位尿道壓為14.67±2.16cmH2O，B組(尿道狹窄組)手術(shù)部位尿道壓為27.83±3.71cmH2O，兩者比較有明顯差異(p<0.01)。
　　 (3)組織細(xì)胞學(xué)：HE染色提示，A組尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)3-4層，排列規(guī)則，未見炎性細(xì)胞；B組尿道有少量上皮細(xì)胞不均勻覆蓋，個別地方?jīng)]有上皮細(xì)胞，中間有中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分布。
　　 結(jié)論：運(yùn)用顯微外科技術(shù)進(jìn)行局部尿道粘膜剝除術(shù)可以成功

4、制造出新西蘭大白兔尿道狹窄模型，并且具有很好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性以及狹窄段長度的可控性。膀胱尿道造影、尿道測壓和組織細(xì)胞學(xué)是鑒定尿道狹窄比較可靠的方法。
　　 第二部分兔尿道上皮細(xì)胞在多孔絲素蛋白支架中的培養(yǎng)
　　 目的：研究兔尿道上皮細(xì)胞體外的培養(yǎng)擴(kuò)增情況以及在多孔絲素蛋白支架上的生長情況，探索適合尿道上皮細(xì)胞生長的支架孔徑和實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔尿道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。提取新西蘭大白兔尿道

5、粘膜，通過漂洗、消化、靜置、過濾、離心、懸浮、培養(yǎng)等步驟進(jìn)行尿道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，經(jīng)傳代后用相差顯微鏡和免疫組化角蛋白抗體進(jìn)行尿道上皮細(xì)胞的鑒定；(2)按照不同孔徑分成三組：A組，多孔絲素蛋白支架孔徑為20μm；B組，孔徑為40μm；C組，孔徑為80μm；(3)在相同實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，將尿道上皮細(xì)胞接種到三組多孔絲素蛋白支架上，3天后用掃描電鏡和光譜分析儀檢測細(xì)胞代謝產(chǎn)物來觀察各組細(xì)胞的生長情況。
　　 結(jié)果：(1)順利提取新西蘭大

6、白兔的尿道粘膜，并完成體外原代和傳代培養(yǎng)，用相差顯微鏡和免疫組化角蛋白抗體的方法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為尿道上皮細(xì)胞；
　　 (2)將傳代的尿道上皮細(xì)胞植入3組多孔絲素蛋白支架培養(yǎng)后，光譜分析儀在檢測細(xì)胞代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)A組(孔徑為20μm)的細(xì)胞代謝最旺盛，而且掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)A組的多孔絲素蛋白支架上有尿道上皮細(xì)胞生長。
　　 結(jié)論：取材于新西蘭大白兔尿道粘膜的尿道上皮細(xì)胞可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并且在孔徑為20μm的片狀多孔絲素蛋白支

7、架上能夠生長。
　　 第三部分片狀多孔絲素蛋白支架在新西蘭大白兔體內(nèi)降解情況的初步探索
　　 目的：初步探索片狀多孔絲素蛋白支架在動物體內(nèi)的降解情況。
　　 方法：(1)將孔徑為20μm的片狀多孔絲素蛋白支架修剪成10*10*2 mm(長*寬*高)方形小塊共18枚，6枚一組植入新西蘭大白兔背部皮下；(2)術(shù)后第2、4、8周，切開每只實(shí)驗(yàn)兔的2個切口，取出絲素蛋白小塊。測量絲素蛋白小塊的大小，觀察絲素蛋白與宿主的反

8、應(yīng)。
　　 結(jié)果：(1)體積上--第2周，6片絲素蛋白小塊基本都呈原來的形狀，平均體積約為156±9.30mm3(較基線周體積縮小了17.89％)，與基線周相比，有明顯差異(p=0.014)；第4周，6片絲素蛋白小塊均失去原來形狀，呈不規(guī)則形，平均體積約為38.33±14.56mm3(較基線周體積縮小了80.00%)，與基線周相比，有明顯差異(p<0.001)；第8周，6片絲素蛋白小塊呈不規(guī)則形，平均體積約為7.00±2.00m

9、m3(較基線周體積縮小了96.32%)，與基線周相比，有明顯差異(p<0.001)。；(2)形態(tài)上--第2周，6片絲素蛋白小塊基本都呈原來的形狀，并且與周圍組織無明顯粘連，容易分離；第4周，6片絲素蛋白小塊均失去原來形狀，呈不規(guī)則形，與周圍組織有粘連溶解，易分離；第8周，6片絲素蛋白小塊呈不規(guī)則形，明顯變小但未完全降解，與周圍組織粘連溶解不易分離。
　　 結(jié)論：20μm孔徑的絲素蛋白在實(shí)驗(yàn)兔體內(nèi)8周時，體積縮小約96.32%，但

10、同時伴局部的粘連和溶解。
　　 第四部分片狀多孔絲素蛋白支架在長段尿道修補(bǔ)中的初步實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：初步探索用片狀多孔絲素蛋白支架修補(bǔ)長段尿道狹窄和缺損。
　　 方法：(1)將24只新西蘭雄性大白兔隨機(jī)分成4組：A組為正常對照組；B組為尿道狹窄組--剝除實(shí)驗(yàn)兔的尿道粘膜，不做修補(bǔ)，讓其自行愈合；C組為多孔絲素蛋白支架組--剝除實(shí)驗(yàn)兔的尿道粘膜后，用多孔絲素蛋白支架進(jìn)行修補(bǔ)；D組為尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架

11、復(fù)合物組--剝除實(shí)驗(yàn)兔的尿道粘膜后，用尿道上皮細(xì)胞.多孔絲素蛋白支架復(fù)合物進(jìn)行修補(bǔ)。每組各6只，平均體重(2.87±0.16)kg；(2)4組共同飼養(yǎng)2個月后，分別進(jìn)行膀胱尿道造影、尿動力檢測(尿道測壓)和組織細(xì)胞學(xué)檢測，以觀察片狀多孔絲素蛋白支架以及尿道上皮細(xì)胞-多孔絲素蛋白支架復(fù)合物在修補(bǔ)長段尿道狹窄和缺損中的作用。
　　 結(jié)果：A組6只實(shí)驗(yàn)兔完成2個月的實(shí)驗(yàn)。B組1只實(shí)驗(yàn)兔在行尿道剝離術(shù)時，腹腔注射頭孢三嗪5分鐘后出現(xiàn)休克

12、表現(xiàn)死亡，補(bǔ)充1只實(shí)驗(yàn)兔后，6只實(shí)驗(yàn)兔完成2個月的實(shí)驗(yàn)。C組有1只實(shí)驗(yàn)兔在6周時出現(xiàn)死亡，其余5只完成實(shí)驗(yàn)。D組有1只實(shí)驗(yàn)兔在第4周時，多孔絲素蛋白支架復(fù)合物脫出，退出實(shí)驗(yàn)；另有1只實(shí)驗(yàn)兔在第5周時出現(xiàn)死亡，其余4只完成實(shí)驗(yàn)。
　　 (1)尿道造影--術(shù)后2月，B組的造影片顯示尿道粘膜連續(xù)性的改變，尿道管徑變細(xì)，造影劑通過時不連貫，呈現(xiàn)尿道狹窄的表現(xiàn)，與A組相比有明顯的尿道狹窄表現(xiàn)。C、D組膀胱尿道造影提示雖然尿道粘膜的連續(xù)性及

13、管腔的直徑都較A組有所加劇，但與B組相比，尿道粘膜的連續(xù)性及管腔的直徑都有所好轉(zhuǎn)。C組和D組之間，視覺上兩組的尿道粘膜連續(xù)性及尿道管腔的大小無明顯差異。
　　 (2)尿道測壓-B、C、D組術(shù)后2月手術(shù)部位的尿道阻力明顯增高，平均值分別為27.83±3.71cmH2O、18.00±1.87cmH2O、18.00±1.41cmH2O，A組尿道阻力的平均值為14.67±2.16cmH2O，后3組分別與A組相比均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<

14、0.05)。C組和D組分別與B組也有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。但是，C組和D組的尿道阻力平均值之間無明顯差異(p=1.00)。尿道測壓圖上，A照組則呈現(xiàn)平緩的低壓波形；B組尿道手術(shù)部位呈現(xiàn)明顯的密集高壓波形；C、D組的手術(shù)區(qū)域的尿道阻力波形相似，均較B組低緩。
　　 (3)組織細(xì)胞學(xué)-HE染色提示，A組尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)3-4層，排列規(guī)則，未見炎性細(xì)胞；B組尿道有少量上皮細(xì)胞不均勻覆蓋，個別地方?jīng)]有上皮細(xì)胞，中間

15、有中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分布；C組尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)4-5層，有炎性細(xì)胞；D組尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)4-5層，排列規(guī)則，偶見少量炎性細(xì)胞。C組和D組與B組相比有明顯的修復(fù)效果，而C組和D組之間無明顯差異
　　 結(jié)論：通過對4組實(shí)驗(yàn)兔的比較研究，我們可以初步得出：運(yùn)用多孔絲素蛋白支架作為長段尿道缺損的修補(bǔ)替代材料，可以對尿道狹窄有明顯的改善作用。但是尿道上皮細(xì)胞/多孔絲素蛋白支架復(fù)合物對長段尿道狹窄的改善程度沒有明顯優(yōu)于