絲素蛋白支架在尿道狹窄重建中的實驗研究.pdf

1、第一部分新西蘭大白兔尿道狹窄模型的建立
　　 目的：探索新西蘭大白兔尿道狹窄模型建立的方法。
　　 方法：將12只雄性新西蘭大白兔隨機分成兩組，每組6只，平均體重2.84±0.15kg。A組為正常對照組。B組為尿道狹窄組：在戊巴比妥鈉溶液靜脈注射麻醉后，剝除1.0cm左右尿道粘膜，逐層縫合后留置F-8橡皮導尿管并固定。所有操作均在10倍光鏡下，運用顯微器械完成。術后觀察兩組實驗兔，在飼養(yǎng)2個月時分別行順行膀胱尿道造影、尿

2、道測壓和組織細胞學檢測。術中和術后一周腹腔注射抗生素以預防感染。
　　 結果：B組1只新西蘭大白兔在麻醉后腹腔注射抗生素時出現(xiàn)休克表現(xiàn)，搶救無效死亡。在補充一只尿道狹窄組大白兔后，兩組實驗兔均順利完成實驗。術后1周左右，留置導尿管自行脫落。觀察發(fā)現(xiàn)B組術后兩個月后明顯較第一組焦躁。
　　 (1)膀胱尿道造影：術后兩個月順行膀胱尿道造影尿道狹窄組較對照組有明顯狹窄，尿道管腔變細，粘膜粗糙不連續(xù)。
　　 (2)尿道測

3、壓：A組(正常對照組)手術部位尿道壓為14.67±2.16cmH2O，B組(尿道狹窄組)手術部位尿道壓為27.83±3.71cmH2O，兩者比較有明顯差異(p<0.01)。
　　 (3)組織細胞學：HE染色提示，A組尿道上皮細胞均勻覆蓋，層數(shù)3-4層，排列規(guī)則，未見炎性細胞；B組尿道有少量上皮細胞不均勻覆蓋，個別地方?jīng)]有上皮細胞，中間有中性粒細胞及淋巴細胞分布。
　　 結論：運用顯微外科技術進行局部尿道粘膜剝除術可以成功

4、制造出新西蘭大白兔尿道狹窄模型，并且具有很好的穩(wěn)定性、可重復性以及狹窄段長度的可控性。膀胱尿道造影、尿道測壓和組織細胞學是鑒定尿道狹窄比較可靠的方法。
　　 第二部分兔尿道上皮細胞在多孔絲素蛋白支架中的培養(yǎng)
　　 目的：研究兔尿道上皮細胞體外的培養(yǎng)擴增情況以及在多孔絲素蛋白支架上的生長情況，探索適合尿道上皮細胞生長的支架孔徑和實驗環(huán)境。
　　 方法：(1)新西蘭大白兔尿道上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定。提取新西蘭大白兔尿道

5、粘膜，通過漂洗、消化、靜置、過濾、離心、懸浮、培養(yǎng)等步驟進行尿道上皮細胞的原代培養(yǎng)，經(jīng)傳代后用相差顯微鏡和免疫組化角蛋白抗體進行尿道上皮細胞的鑒定；(2)按照不同孔徑分成三組：A組，多孔絲素蛋白支架孔徑為20μm；B組，孔徑為40μm；C組，孔徑為80μm；(3)在相同實驗環(huán)境下，將尿道上皮細胞接種到三組多孔絲素蛋白支架上，3天后用掃描電鏡和光譜分析儀檢測細胞代謝產(chǎn)物來觀察各組細胞的生長情況。
　　 結果：(1)順利提取新西蘭大

6、白兔的尿道粘膜，并完成體外原代和傳代培養(yǎng)，用相差顯微鏡和免疫組化角蛋白抗體的方法鑒定所培養(yǎng)的細胞為尿道上皮細胞；
　　 (2)將傳代的尿道上皮細胞植入3組多孔絲素蛋白支架培養(yǎng)后，光譜分析儀在檢測細胞代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)A組(孔徑為20μm)的細胞代謝最旺盛，而且掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)A組的多孔絲素蛋白支架上有尿道上皮細胞生長。
　　 結論：取材于新西蘭大白兔尿道粘膜的尿道上皮細胞可在體外培養(yǎng)擴增，并且在孔徑為20μm的片狀多孔絲素蛋白支

7、架上能夠生長。
　　 第三部分片狀多孔絲素蛋白支架在新西蘭大白兔體內(nèi)降解情況的初步探索
　　 目的：初步探索片狀多孔絲素蛋白支架在動物體內(nèi)的降解情況。
　　 方法：(1)將孔徑為20μm的片狀多孔絲素蛋白支架修剪成10*10*2 mm(長*寬*高)方形小塊共18枚，6枚一組植入新西蘭大白兔背部皮下；(2)術后第2、4、8周，切開每只實驗兔的2個切口，取出絲素蛋白小塊。測量絲素蛋白小塊的大小，觀察絲素蛋白與宿主的反

8、應。
　　 結果：(1)體積上--第2周，6片絲素蛋白小塊基本都呈原來的形狀，平均體積約為156±9.30mm3(較基線周體積縮小了17.89％)，與基線周相比，有明顯差異(p=0.014)；第4周，6片絲素蛋白小塊均失去原來形狀，呈不規(guī)則形，平均體積約為38.33±14.56mm3(較基線周體積縮小了80.00%)，與基線周相比，有明顯差異(p<0.001)；第8周，6片絲素蛋白小塊呈不規(guī)則形，平均體積約為7.00±2.00m

9、m3(較基線周體積縮小了96.32%)，與基線周相比，有明顯差異(p<0.001)。；(2)形態(tài)上--第2周，6片絲素蛋白小塊基本都呈原來的形狀，并且與周圍組織無明顯粘連，容易分離；第4周，6片絲素蛋白小塊均失去原來形狀，呈不規(guī)則形，與周圍組織有粘連溶解，易分離；第8周，6片絲素蛋白小塊呈不規(guī)則形，明顯變小但未完全降解，與周圍組織粘連溶解不易分離。
　　 結論：20μm孔徑的絲素蛋白在實驗兔體內(nèi)8周時，體積縮小約96.32%，但

10、同時伴局部的粘連和溶解。
　　 第四部分片狀多孔絲素蛋白支架在長段尿道修補中的初步實驗研究
　　 目的：初步探索用片狀多孔絲素蛋白支架修補長段尿道狹窄和缺損。
　　 方法：(1)將24只新西蘭雄性大白兔隨機分成4組：A組為正常對照組；B組為尿道狹窄組--剝除實驗兔的尿道粘膜，不做修補，讓其自行愈合；C組為多孔絲素蛋白支架組--剝除實驗兔的尿道粘膜后，用多孔絲素蛋白支架進行修補；D組為尿道上皮細胞/多孔絲素蛋白支架

11、復合物組--剝除實驗兔的尿道粘膜后，用尿道上皮細胞.多孔絲素蛋白支架復合物進行修補。每組各6只，平均體重(2.87±0.16)kg；(2)4組共同飼養(yǎng)2個月后，分別進行膀胱尿道造影、尿動力檢測(尿道測壓)和組織細胞學檢測，以觀察片狀多孔絲素蛋白支架以及尿道上皮細胞-多孔絲素蛋白支架復合物在修補長段尿道狹窄和缺損中的作用。
　　 結果：A組6只實驗兔完成2個月的實驗。B組1只實驗兔在行尿道剝離術時，腹腔注射頭孢三嗪5分鐘后出現(xiàn)休克

12、表現(xiàn)死亡，補充1只實驗兔后，6只實驗兔完成2個月的實驗。C組有1只實驗兔在6周時出現(xiàn)死亡，其余5只完成實驗。D組有1只實驗兔在第4周時，多孔絲素蛋白支架復合物脫出，退出實驗；另有1只實驗兔在第5周時出現(xiàn)死亡，其余4只完成實驗。
　　 (1)尿道造影--術后2月，B組的造影片顯示尿道粘膜連續(xù)性的改變，尿道管徑變細，造影劑通過時不連貫，呈現(xiàn)尿道狹窄的表現(xiàn)，與A組相比有明顯的尿道狹窄表現(xiàn)。C、D組膀胱尿道造影提示雖然尿道粘膜的連續(xù)性及

13、管腔的直徑都較A組有所加劇，但與B組相比，尿道粘膜的連續(xù)性及管腔的直徑都有所好轉(zhuǎn)。C組和D組之間，視覺上兩組的尿道粘膜連續(xù)性及尿道管腔的大小無明顯差異。
　　 (2)尿道測壓-B、C、D組術后2月手術部位的尿道阻力明顯增高，平均值分別為27.83±3.71cmH2O、18.00±1.87cmH2O、18.00±1.41cmH2O，A組尿道阻力的平均值為14.67±2.16cmH2O，后3組分別與A組相比均有明顯的統(tǒng)計學差異(p<

14、0.05)。C組和D組分別與B組也有明顯的統(tǒng)計學差異(p<0.01)。但是，C組和D組的尿道阻力平均值之間無明顯差異(p=1.00)。尿道測壓圖上，A照組則呈現(xiàn)平緩的低壓波形；B組尿道手術部位呈現(xiàn)明顯的密集高壓波形；C、D組的手術區(qū)域的尿道阻力波形相似，均較B組低緩。
　　 (3)組織細胞學-HE染色提示，A組尿道上皮細胞均勻覆蓋，層數(shù)3-4層，排列規(guī)則，未見炎性細胞；B組尿道有少量上皮細胞不均勻覆蓋，個別地方?jīng)]有上皮細胞，中間

15、有中性粒細胞及淋巴細胞分布；C組尿道上皮細胞均勻覆蓋，層數(shù)4-5層，有炎性細胞；D組尿道上皮細胞均勻覆蓋，層數(shù)4-5層，排列規(guī)則，偶見少量炎性細胞。C組和D組與B組相比有明顯的修復效果，而C組和D組之間無明顯差異
　　 結論：通過對4組實驗兔的比較研究，我們可以初步得出：運用多孔絲素蛋白支架作為長段尿道缺損的修補替代材料，可以對尿道狹窄有明顯的改善作用。但是尿道上皮細胞/多孔絲素蛋白支架復合物對長段尿道狹窄的改善程度沒有明顯優(yōu)于