絲素蛋白膜修復(fù)兔尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【研究背景】 因先天因素、損傷、炎癥或腫瘤等原因造成尿道缺損的治療一直是泌尿外科的難題，目前文獻(xiàn)報(bào)道臨床治療方法多種多樣，但其修復(fù)多用自身其他組織替代，如用自體皮膚粘膜、膀胱粘膜、口腔粘膜或闌尾等，或者游離松解尿道斷端后行端端縫合；但這些方法以犧牲正常組織為代價(jià)，手術(shù)創(chuàng)傷大，加重患者的創(chuàng)傷，且術(shù)后并發(fā)癥多，效果不甚理想。 組織工程方法是尿道缺損修復(fù)的一個(gè)方向，并取得了突破性進(jìn)展，最初的研究采用在人工合成細(xì)胞支架上種植尿道

2、粘膜及平滑肌細(xì)胞修復(fù)尿道缺損，近年來多用小腸粘膜下層(SIS)、膀胱粘膜下層(BAMG)或脫細(xì)胞基質(zhì)支架(ECM)。目前尿道組織工程研究常用的細(xì)胞支架有人工合成細(xì)胞支架、天然材料細(xì)胞支架及脫細(xì)胞基質(zhì)支架。尿道組織工程雖然取得了很大進(jìn)步，但尚未找到理想的細(xì)胞支架，仍有大量問題需要解決，存在問題：①人工合成細(xì)胞支架的組織相容性較差，引起不同程度的炎癥反應(yīng)，且價(jià)格昂貴；②天然材料細(xì)胞支架及脫細(xì)胞基質(zhì)支架來源缺乏，加工能力有限，耗資高，難以形成

3、產(chǎn)業(yè)化。因此研究生物性能好、價(jià)格低廉、原料來源豐富的細(xì)胞支架是組織工程學(xué)的一個(gè)重要課題?？蒲腥藛T一直致力于研究、探索開發(fā)新型的細(xì)胞支架，主要在原材料、制作工藝、支架材料改性及表面修飾等方面尋找突破點(diǎn)。 蠶絲作為一種天然的高分子材料近年來受到人們的廣泛重視，其提取物絲素蛋白是蠶絲的重要組成成分，其無毒性、無刺激作用，對機(jī)體細(xì)胞粘附能力強(qiáng)，具有良好的物理化學(xué)性能和生物相容性，以絲素蛋白為原料制成的組織工程細(xì)胞支架、手術(shù)縫線、隱形眼鏡

4、、人工血管、皮膚創(chuàng)面保護(hù)膜、硬腦膜修補(bǔ)材料效果良好，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。同時(shí)絲素蛋白來源豐富，價(jià)格低廉，具有巨大的潛力和優(yōu)勢，但其作為細(xì)胞支架用于修復(fù)尿道缺損尚未有報(bào)道。 【目的】 本研究旨在探索絲素蛋白膜作為組織工程細(xì)胞支架修復(fù)尿道缺損的可行性及效果。 【材料與方法】 1．動物和材料：雄性新西蘭兔(2.5-4.5Kg)24只(南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)；絲素蛋白膜：孔徑150～250lain，

5、孔隙率85％～95％(本材料由浙江大學(xué)閔思佳教授惠贈)；廣譜細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(PCK)(博士德公司)。 2．動物分組：24只兔隨機(jī)分成3組：實(shí)驗(yàn)組(n=12)，對照組Ⅰ(n=6)，對照組Ⅱ(n=6)。 3．實(shí)驗(yàn)方法： 3．1實(shí)驗(yàn)組：游離出尿道海綿體，將尿道海綿體切除1.5cm，用1.5cm長絲素蛋白支架修復(fù)尿道缺損； 3．2對照組Ⅰ：行尿道海綿體游離后即逐層縫合海綿體包膜、皮下組織及皮膚； 3

6、．3對照組Ⅱ：游離出尿道海綿體，將尿道海綿體切除1.5cm后逐層縫合切口。 4．檢測方法：組織再生情況觀察及逆行尿道造影4．1實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后2、4周、8周、16周每次3只行逆行尿道造影，然后處死取材行蘇木精-伊紅(HE)染色、Van Gieson(VG)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察組織再生情況； 4．2對照組Ⅰ及對照組Ⅱ分別在術(shù)后8周及16周每次各取3只行逆行尿道造影，然后處死取材行蘇木精-伊紅(HE)染色、Van Gies

7、on(VG)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察組織再生情況； 【結(jié)果】 1．實(shí)驗(yàn)中兔存活及手術(shù)切口愈合情況：24只兔實(shí)驗(yàn)過程中無一例死亡。對照組Ⅱ 1只兔于術(shù)后2周發(fā)生尿瘺。 2．組織標(biāo)本肉眼觀察：對照組Ⅰ手術(shù)區(qū)尿道無缺損及瘢痕形成，無尿道狹窄；對照組Ⅱ術(shù)后8周瘢痕形成，可見部分缺損，16周時(shí)手術(shù)區(qū)較對照組Ⅰ狹窄，組織質(zhì)地堅(jiān)韌；實(shí)驗(yàn)組絲素蛋白膜均固定于原位，術(shù)后2周絲素蛋白膜無明顯變化，表面部分被組織覆蓋；4周時(shí)絲素蛋白

8、膜已部分降解，表面覆蓋的組織增多；8周時(shí)，絲素蛋白膜進(jìn)一步降解成碎片狀，組織均勻覆蓋；16周修復(fù)區(qū)絲素蛋白膜已難于分辨，修復(fù)區(qū)與對照組Ⅰ無明顯差別。 3．逆行尿道造影示：對照組Ⅰ6只兔無尿道狹窄、尿瘺及梗阻；對照組Ⅱ除1只兔出現(xiàn)尿瘺未行造影檢查外，其余5只兔均有不同程度狹窄，手術(shù)區(qū)顯僵硬感；實(shí)驗(yàn)組12只兔未見明顯狹窄，無尿瘺及梗阻，術(shù)后2周時(shí)修復(fù)區(qū)粗糙、不光滑，術(shù)后8周后尿道造影與對照組Ⅰ無明顯差異。 4．組織學(xué)檢查：蘇

9、木精-伊紅(HE)及Van Gieson(VG)染色4．1對照組Ⅰ術(shù)后8周及16周尿道組織結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別，尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)約4-5層，排列規(guī)則，未見炎癥細(xì)胞，粘膜下可見較多的平滑肌細(xì)胞，無纖維化形成。 4．2對照組Ⅱ8周時(shí)腔壁纖維化形成，可見大量的纖維組織及成纖維細(xì)胞，大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失；16周仍以纖維組織為主，瘢痕化形成，可見陳舊性纖維組織，上皮細(xì)胞增多，排列混亂，偶可見少量平滑肌細(xì)胞。 4．3實(shí)驗(yàn)組術(shù)后

10、2周修復(fù)區(qū)未見明顯上皮細(xì)胞覆蓋，偶可見少數(shù)上皮細(xì)胞，絲素蛋白支架網(wǎng)眼中有大量炎癥細(xì)胞浸潤，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞；4周時(shí)仍可見較多炎癥細(xì)胞，絲素蛋白支架表面粘附細(xì)胞排列不均勻，層數(shù)約6-8層；8周時(shí)尿道上皮細(xì)胞排列較4周時(shí)均勻，漸趨向規(guī)則，層數(shù)約5-7層，偶可見零星平滑肌細(xì)胞及口徑較小的血管組織，炎癥細(xì)胞明顯減少，可見較多的成纖維細(xì)胞及膠原纖維；16周尿道上皮細(xì)胞排列均勻，完全覆蓋，層數(shù)約4-5層，平滑肌細(xì)胞增多

11、，成纖維細(xì)胞及膠原纖維較8周時(shí)減少，排列規(guī)則，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤，可見血管口徑增大，與對照組-Ⅰ相似。5．免疫組織化學(xué)檢查：應(yīng)用廣譜細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色，對照組Ⅰ尿道上皮細(xì)胞呈陽性棕黃色，高倍鏡觀察可見胞漿內(nèi)棕黃色網(wǎng)狀角蛋白顆粒，排列規(guī)則；對照組Ⅱ術(shù)后8周大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失，少數(shù)區(qū)域可見少量上皮細(xì)胞，術(shù)后16周時(shí)上皮細(xì)胞增多，但排列混亂、層數(shù)不一；實(shí)驗(yàn)組尿道粘膜細(xì)胞胞漿呈棕黃色，術(shù)后4周至16周上皮細(xì)胞排列漸趨規(guī)則。 【