絲素蛋白膜修復(fù)犬尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景]: 尿道重建術(shù)中，因先天因素、損傷、炎癥或腫瘤等原因造成尿道缺損的治療一直是泌尿外科的難題，目前文獻(xiàn)報(bào)道臨床治療方法多種多樣，但其修復(fù)多用自身其他組織替代，如用自體皮膚粘膜、膀胱粘膜、口腔粘膜或闌尾等，或者游離松解尿道斷端后行端端縫合；但這些方法以犧牲正常組織為代價(jià)，手術(shù)創(chuàng)傷大，應(yīng)用自身組織更加重患者的創(chuàng)傷，導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥居高不下，效果不甚理想，所以尋找一種全新的方法成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。 新興的組織工程方法是尿道

2、缺損修復(fù)的一個(gè)方向，并取得了突破性進(jìn)展。從最初1971年Court等用硅膠管進(jìn)行尿道替代的動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果不令人滿意，但為尿道替代材料的研究開(kāi)創(chuàng)了新局面。Italiano等用一種由透明質(zhì)酸合成的可降解的支架材料來(lái)修復(fù)兔尿道，7個(gè)月后尿道放射學(xué)檢查見(jiàn)移植物消失，尿道重建，再生組織在一定壓力下具有良好的伸展性，組織學(xué)觀察見(jiàn)再生尿道組織中有過(guò)度的上皮細(xì)胞形成，并有豐富的彈性纖維。最初的研究采用在人工合成細(xì)胞支架上種植尿道粘膜及平滑肌細(xì)胞修復(fù)尿道

3、缺損，近年來(lái)多用小腸粘膜下層(SIS)、膀胱粘膜下層(BAMG)或脫細(xì)胞基質(zhì)支架(ECM)，Sievert等用同種異體脫細(xì)胞尿道基質(zhì)修復(fù)兔長(zhǎng)達(dá)1cm左右的缺損，術(shù)后10天，上皮細(xì)胞從宿主遷移至基質(zhì)支架，術(shù)后3周基質(zhì)支架的尿道管腔完全由上皮細(xì)胞覆蓋，3個(gè)月時(shí)可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞束長(zhǎng)入到基質(zhì)，6個(gè)月時(shí)平滑肌細(xì)胞束覆蓋了三分之一的基質(zhì)支架，尿道動(dòng)力學(xué)示實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組無(wú)差別，8個(gè)月時(shí)行尿道造影未能辨別宿主及移植物，他們認(rèn)為該材料可用于一期尿道重建。傅

4、強(qiáng)等利用脫細(xì)胞膀胱粘膜下筋膜修復(fù)分別修復(fù)兔的尿道1cm左右及2-3cm缺損，其中1cm缺損修復(fù)效果良好，他們也認(rèn)為單純用細(xì)胞外膀胱粘膜下筋膜無(wú)法修復(fù)2-3cm以上缺損。目前尿道組織工程研究常用的細(xì)胞支架有人工合成細(xì)胞支架、天然材料細(xì)胞支架及脫細(xì)胞基質(zhì)支架。尿道組織工程雖然取得了很大進(jìn)步，但尚未找到理想的細(xì)胞支架，仍有大量問(wèn)題需要解決，存在問(wèn)題：①人工合成細(xì)胞支架的組織相容性較差，引起不同程度的炎癥反應(yīng)；②天然材料細(xì)胞支架及脫細(xì)胞基質(zhì)支架

5、來(lái)源缺乏，加工能力有限，耗資高，難以形成產(chǎn)業(yè)化，導(dǎo)致價(jià)格昂貴；③延展性、伸縮性等機(jī)械性能方面尚無(wú)法滿足臨床應(yīng)用。因此研究生物性能好、價(jià)格低廉、原料來(lái)源豐富的細(xì)胞支架是組織工程學(xué)的一個(gè)重要課題?？蒲腥藛T一直致力于研究、探索開(kāi)發(fā)新型的細(xì)胞支架，主要在原材料、制作工藝、支架材料改性及表面修飾等方面尋找突破點(diǎn)，越來(lái)越多的材料進(jìn)入研究人員的篩選范圍。 近年來(lái)，蠶絲作為一種天然的高分子材料受到人們的廣泛重視，其提取物絲素蛋白是蠶絲的重要組成

6、成分，具有無(wú)毒性、無(wú)刺激作用，對(duì)機(jī)體細(xì)胞粘附能力強(qiáng)，具有良好的物理化學(xué)性能和生物相容性，以絲素蛋白為原料制成的組織工程細(xì)胞支架、手術(shù)縫線、隱形眼鏡、人工血管、皮膚創(chuàng)面保護(hù)膜、硬腦膜修補(bǔ)材料效果良好，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。劉春曉及林陽(yáng)彥等將絲素蛋白膜作為細(xì)胞支架用于修復(fù)兔子尿道1.5cm長(zhǎng)度缺損取得良好的效果，但不同長(zhǎng)度缺損修復(fù)效果尚不明確。 [目的]:本研究旨在探索絲素蛋白膜修復(fù)不同長(zhǎng)度尿道缺損的效果. [材料與

7、方法]: 1.動(dòng)物和材料：成年雄性犬(10.0-12.9Kg)14只(廣東肇慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技研究中心提供)；絲素蛋白膜：孔徑150～250μm，孔隙率65％～95％(本材料由浙江大學(xué)閔思佳教授惠贈(zèng))；廣譜細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(PCK)(博士德公司)。 2.動(dòng)物分組：14只犬隨機(jī)分成3組：實(shí)驗(yàn)組I(n=6)，實(shí)驗(yàn)組II(n=6)，對(duì)照組(n=2)。 3.實(shí)驗(yàn)方法： 3.1實(shí)驗(yàn)組I：游離出尿道海綿體，將尿道海

8、綿體段分別切除1.5cm，再用1.5cm長(zhǎng)度絲素蛋白支架修復(fù)尿道缺損：實(shí)驗(yàn)組II：游離出尿道海綿體，將尿道海綿體段分別切除3.0cm，再用3.0cm長(zhǎng)度絲素蛋白支架修復(fù)尿道缺損。 3.2對(duì)照組：行尿道海綿體游離后即逐層縫合海綿體包膜、皮下組織及皮膚； 4.檢測(cè)方法：組織再生情況病理切片觀察及逆行尿道造影 4.1實(shí)驗(yàn)組I及實(shí)驗(yàn)組11分別在術(shù)后6周、12周每次各取1只行逆行尿道造影，然后處死取材行蘇木精-伊紅(HE)

9、染色、VanGieson(VG)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察組織再生情況； 4.2對(duì)照組分別于6周及12周每次各取3只行逆行尿道造影，然后處死取材行蘇木精-伊紅(HE)染色、VanGieson(VG)染色及免疫組織化學(xué)染色觀察組織再生情況； [結(jié)果]: 1.實(shí)驗(yàn)中犬存活及手術(shù)切口愈合情況：14只犬實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)一例死亡. 2.逆行尿道造影示：實(shí)驗(yàn)組I6只動(dòng)物術(shù)后尿路造影未見(jiàn)尿瘺及明顯狹窄，修復(fù)區(qū)6周時(shí)修復(fù)區(qū)稍

10、粗糙、不光滑，術(shù)后12周后與對(duì)照組無(wú)明顯差異；實(shí)驗(yàn)組II6只動(dòng)物均出現(xiàn)尿瘺或管腔狹小、部分充盈缺損，術(shù)后6周和12周無(wú)明顯差異。 3.組織標(biāo)本肉眼觀察：對(duì)照組尿道無(wú)缺損及瘢痕形成，無(wú)尿道狹窄：實(shí)驗(yàn)組I1.5cm修復(fù)區(qū)術(shù)后6周可見(jiàn)少許瘢痕增城，尿道稍狹窄，12周較6周改善；實(shí)驗(yàn)組II3.0cm修復(fù)術(shù)6周瘢痕形成，可見(jiàn)缺損，組織質(zhì)地堅(jiān)韌，12周與6周無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)組所有動(dòng)物修復(fù)區(qū)絲素蛋白膜均固定于原位，術(shù)后6周絲素蛋白膜已部分降解

11、，組織均勻覆蓋，12周修復(fù)區(qū)絲素蛋白膜已難于分辨。 4.組織學(xué)檢查：蘇木精-伊紅(HE)及VanGieson(VG)染色 4.1對(duì)照組術(shù)后6周及12周尿道組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別，尿道上皮細(xì)胞均勻覆蓋，層數(shù)約4-5層，排列規(guī)則，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，粘膜下可見(jiàn)較多的平滑肌細(xì)胞，無(wú)纖維化形成。 4.2實(shí)驗(yàn)組I1.5cm修復(fù)區(qū)術(shù)后6周可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞，絲素蛋白支架表面粘附細(xì)胞排列不均勻，層數(shù)約6-9層，同時(shí)可見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞及膠

12、原纖維；12周尿道上皮細(xì)胞排列均勻，完全覆蓋，層數(shù)約4-5層，平滑肌細(xì)胞增多，成纖維細(xì)胞及膠原纖維較6周時(shí)減少，排列規(guī)則，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)血管口徑增大，與對(duì)照組相似。 4.3實(shí)驗(yàn)組II3.0cm修復(fù)區(qū)6周時(shí)腔壁纖維化形成，可見(jiàn)大量的纖維組織及成纖維細(xì)胞，大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失；12周仍以纖維組織為主，瘢痕化形成，可見(jiàn)陳舊性纖維組織，上皮細(xì)胞增多，排列混亂，偶可見(jiàn)少量平滑肌細(xì)胞，與6周時(shí)無(wú)明顯差別。 5.免疫組織化

13、學(xué)檢查：應(yīng)用廣譜細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色，對(duì)照組尿道上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性棕黃色，高倍鏡觀察可見(jiàn)胞漿內(nèi)棕黃色網(wǎng)狀角蛋白顆粒，排列規(guī)則，術(shù)后6周和12周沒(méi)有明顯區(qū)別；實(shí)驗(yàn)組I1.5cm修復(fù)區(qū)術(shù)后6周可見(jiàn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，術(shù)后12周后趨于規(guī)整，與對(duì)照組無(wú)明顯差別；實(shí)驗(yàn)組II3.0cm修復(fù)區(qū)術(shù)后6周大部分區(qū)域上皮細(xì)胞缺失，少數(shù)區(qū)域可見(jiàn)少量上皮細(xì)胞，術(shù)后12周時(shí)上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯增加，與術(shù)后6周無(wú)明顯區(qū)別。 [結(jié)論]: 絲素蛋白膜能夠誘導(dǎo)尿道