VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG支架修復(fù)重建組織工程尿道的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于缺乏合適的應(yīng)用于臨床的替代材料，泌尿道的修復(fù)與重建一直是臨床上比較棘手的難題。其中，尿道狹窄多由外傷、炎癥、先天性尿道下裂及腫瘤等原因引起，既往多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜等自體組織進(jìn)行修復(fù)重建，但由于存在供區(qū)再次損傷，取材有限，易導(dǎo)致感染、尿瘺、尿道再狹窄、尿道憩室等并發(fā)癥。因此，研究者嘗試?yán)媒M織工程技術(shù)再造尿道上皮復(fù)合材料進(jìn)行尿道重建。但復(fù)合材料回值體內(nèi)易出現(xiàn)種子細(xì)胞凋亡、材料降解引起局部炎癥反應(yīng)，回植材料缺乏血供，導(dǎo)致

2、組織纖維化增生，瘢痕形成，限制了其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。納米微囊技術(shù)具有緩釋、保護(hù)負(fù)載蛋白活性等優(yōu)點(diǎn)，PLGA是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于臨床的高分子材料，VEGF能夠特異性的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管的形成，增加血管的通透性，為替代組織提供良好地微環(huán)境。因此VEGF-PLGA納米微囊為組織工程材料再血管化提供了一種新的思路和技術(shù)可能。本實(shí)驗(yàn)通過制備VEGF-PLGA納米微囊，并考察其體外、體內(nèi)的緩釋性能，并與BMGA交聯(lián)后復(fù)合口

3、腔上皮細(xì)胞進(jìn)行尿道修復(fù)重建，為尿道修復(fù)重建組織工程再血管化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一章納米微球的制備與性能評估
　　1、目的
　　優(yōu)化納米微球的制備工藝，評估其性能參數(shù)。
　　2、材料和方法
　　以PLGA為載體材料，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備芯材藥物（諾氟沙星）微球，以包封率、載藥量、粒徑及其分布等為評價指標(biāo)，對諾氟沙星微球的處方和工藝因素進(jìn)行單因素考察，在此基礎(chǔ)上通過正交設(shè)計(jì)篩選出最優(yōu)處方。對優(yōu)選處方制得的

4、諾氟沙星微球的外觀形態(tài)、納米微球粒徑、包封率、載藥量進(jìn)行考察研究和評價。對最優(yōu)處方制備的諾氟沙星PLGA微球進(jìn)行體外釋放研究，考察不同釋放介質(zhì)、不同釋放條件下的體外釋放情況，評價制備所得微球的體外緩釋效果。
　　3、結(jié)果
　　建立了紫外分光光度計(jì)法測定諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于諾氟沙星原料藥相關(guān)性質(zhì)及穩(wěn)定性考察和微球制劑載藥量、包封率的測定。處方前研究工作結(jié)果顯示25℃時諾氟沙星在水中的平衡溶解度為10mg/mL。諾氟沙星的丙

5、酮:水(1:9)溶液7天內(nèi)穩(wěn)定。通過單因素試驗(yàn)考察和正交試驗(yàn)對諾氟沙星PLGA微球的制備工藝和處方進(jìn)行了優(yōu)化，最優(yōu)條件下制得的諾氟沙星PLGA微球樣品的載藥量為2.00±0.10％、包封率為98.98±2.75％。電子掃描顯微鏡進(jìn)行觀察，微球大小均勻，顆粒圓整，表面光滑。通過紫外分光光度計(jì)法用于微球體外釋藥的測定;建立了微球的體外釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定了以37℃生理鹽水溶液為釋放介質(zhì)的透析法進(jìn)行制劑體外釋放的測定。體外釋放的結(jié)果表明諾氟沙星

6、微球在體外釋放條件下無明顯突釋效應(yīng)，具有緩釋效果，體外釋放時間可以持續(xù)達(dá)到30天。
　　4、結(jié)論
　　本文通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備理想的PLGA納米微球，其制備方法可操作性好，獲取量滿意，符合本課題前期要求。通過正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究掌握了諾氟沙星納米微球的部分理化性質(zhì)，為微球的制備提供了支持。通過處方優(yōu)化制備的諾氟沙星PLGA納米微球具有理想的載藥量，較高的包封率和明顯的體外緩釋效果，達(dá)到下一步包裹蛋白活性芯材的技術(shù)要求。

7、>　　第二章VEGF-PLGA納米微囊的制備及體外緩釋實(shí)驗(yàn)
　　1、目的
　　探討雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備VEGF-PLGA納米微囊的制備及體外緩釋實(shí)驗(yàn)
　　2、材料和方法
　　以PLGA為載體材料，采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備芯材為活性生長因子的納米微囊，以包封率、載藥量、粒徑等為評價指標(biāo)，通過前期納米微球的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，通過正交設(shè)計(jì)篩選出最優(yōu)處方。對優(yōu)選處方制得的VEGF-PLGA納米微囊的外觀形態(tài)、納米微囊粒徑、包

8、封率、載藥量進(jìn)行考察研究和評價。并對最優(yōu)處方制備的VEGF-PLGA微囊進(jìn)行體外釋放研究，評價制備所得微球的體外緩釋效果。
　　3、結(jié)果
　　通過單因素試驗(yàn)考察和正交試驗(yàn)對VEGF-PLGA微球的制備工藝和處方進(jìn)行了優(yōu)化，最優(yōu)條件下制得的VEGF-PLGA納米微囊樣品。負(fù)染電子掃描顯微鏡進(jìn)行觀察，微球大小均勻，顆粒圓潤。采用紫外分光光度計(jì)法用于納米微囊體外釋藥的測定;確定了以37℃生理鹽水溶液為釋放介質(zhì)的透析法進(jìn)行制劑體外釋

9、放的測定，建立了其體外釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線。體外釋放的結(jié)果表明VEGF-PLGA在體外釋放條件下無明顯突釋效應(yīng)，具有緩釋效果，體外釋放時間可以持續(xù)達(dá)到15天。
　　4、結(jié)論
　　本文通過雙乳化-溶劑揮發(fā)法制備包裹VEGF的PLGA納米微囊。通過單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化試驗(yàn)探索乳化能量、乳化時間等因素對納米微囊的影響。通過處方優(yōu)化制備的VEGF-PLGA微囊具有良好的載藥量，較高的包封率和理想的體外緩釋效果，可滿足植入替代組織局部持續(xù)緩釋

10、VEGF的要求。并為本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的開展，將VEGF-PLGA納米微囊修飾支架材料應(yīng)用于尿道重建的研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三章VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG支架的試驗(yàn)研究
　　1、目的
　　包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾BAMG支架，并以口腔黏膜上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合進(jìn)行細(xì)胞相容性試驗(yàn)。
　　2、材料和方法
　　采用不同的方法將前期制備的VEGF-PLGA納米微囊與我實(shí)驗(yàn)室制備的

11、BAMG支架進(jìn)行復(fù)合，尋求最佳的納米微囊與支架材料交聯(lián)方法，并將修飾過的支架材料與口腔黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，驗(yàn)證其細(xì)胞相容性及與細(xì)胞的復(fù)合能力。
　　3、結(jié)果
　　經(jīng)過不同交聯(lián)方式對比，VEGF-PLGA與BAMG支架交聯(lián)良好，增加了支架材料的比表面積程度，其孔隙率不變，使細(xì)胞更易于黏附、生長，四唑鹽比色法(MTT)、流式細(xì)胞儀檢測及掃描電子顯微鏡觀察，顯示細(xì)胞活性、生長增殖良好。
　　4、結(jié)論
　　實(shí)驗(yàn)證明包

12、裹VEGF的新型PLGA納米微囊修飾支架效果良好，增加了支架材料的表面粗糙度及比表面積，易于口腔黏膜上皮細(xì)胞黏附更適合其作為種子細(xì)胞在支架材料上的貼附、生長、增殖和分化，為本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)部分的進(jìn)一步開展提供了堅(jiān)實(shí)的前期基礎(chǔ)。
　　第四章口腔黏膜上皮細(xì)胞復(fù)合VEGF-PLGA修飾的BAMG支架重建組織工程尿道的研究
　　1、目的
　　探討口腔黏膜上皮細(xì)胞作為尿路上皮細(xì)胞的替代種子細(xì)胞，種植于包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾

13、的BAMG支架回植于兔模型組織工程尿道修復(fù)重建的研究。
　　2、方法
　　將前期制備的VEGF-PLGA納米微囊交聯(lián)于BAMG支架，與口腔黏膜上皮細(xì)胞復(fù)合，并分組進(jìn)行兔模型的前尿道補(bǔ)片式替代重建手術(shù)（A組:單純BAMG支架修復(fù)重建尿道組;B組:空白PLGA納米微囊修飾的BAMG支架修復(fù)重建組;C組:包裹VEGF的PLGA納米微囊修飾的BAMG支架修復(fù)重建組），每組分別術(shù)后1周，2周、1月、2月、3月行尿道造影，并處死后取替代

14、段組織行包括大體標(biāo)本觀測，及HE、masson、免疫組化等相關(guān)組織學(xué)檢測。
　　3、結(jié)果
　　兔模型尿道重建術(shù)后，尿道造影顯示單純BAMGgroup，空白PLGA修飾BAMGgroup術(shù)后均出現(xiàn)不同程度狹窄;空白PLGA修飾BAMG組術(shù)后2周出現(xiàn)輕度尿道狹窄，術(shù)后1月、3月尿道造影顯示比術(shù)后2周尿道狹窄有所緩解，VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG組尿道造影顯示尿道通暢。大體標(biāo)本觀測顯示單純BAMG組、空白PLGA/BAM

15、G組尿道組織替代段局部疤痕明顯;VEGF-PLGA納米微囊修飾BAMG組術(shù)后2周出現(xiàn)輕度局部黏膜攣縮，術(shù)后2周、1月替代段攣縮較前明顯減輕，于術(shù)后2月、3月觀測，替代段尿道于正常尿道無明顯差別。HE、masson及免疫組化組織學(xué)檢測單純BAMG組及空白PLGA納米微囊修飾BAMG組術(shù)后2周即出現(xiàn)組織纖維化、膠原蛋白大量沉著、膠原蛋白排列紊亂，空白PLGA納米微囊修飾BAMG組較單純支架組膠原蛋白沉積少;VEGF-PLGA修飾BAMG支架

16、組少量膠原蛋白沉著，替代組織可見大量新生微血管生成，尿道管腔面細(xì)胞生長良好。
　　4、結(jié)論
　　VEGF-PLGA納米微囊修飾的BAMG支架與口腔黏膜細(xì)胞復(fù)合后進(jìn)行兔模型尿道修復(fù)重建，術(shù)后通過尿道造影、大體標(biāo)本觀察，組織學(xué)等系列檢測，證明對比單純BAMG回植，及空白PLGA納米微囊修飾的BAMG回植，VEFG-PLGA納米微囊修飾的BAMG組能夠在替代組織局部形成新生血管，明顯減少組織纖維化，在一定程度上減輕尿道重建段的疤痕