納米銀組織工程外周神經(jīng)支架對(duì)坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)的一大難題，自體神經(jīng)移植是臨床上修復(fù)神經(jīng)缺損常用的方法，但自體神經(jīng)來(lái)源有限，難于在臨床上開(kāi)展應(yīng)用。而異體神經(jīng)或異種神經(jīng)更受到免疫排斥反應(yīng)的限制。近年來(lái)，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有良好生物相容性的支架材料修復(fù)外周神經(jīng)損傷成為研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用神經(jīng)修復(fù)支架橋接神經(jīng)兩斷端，引導(dǎo)神經(jīng)軸突軸向生長(zhǎng)，避免神經(jīng)瘤的形成，為神經(jīng)再生提供一個(gè)相對(duì)隔絕的微環(huán)境。理想的組織工程化周圍神經(jīng)必須具備三個(gè)基本要素：①支架：是神經(jīng)軸突黏附

2、和爬行的臨時(shí)性支持結(jié)構(gòu)；②種子細(xì)胞或蛋白：是促進(jìn)和引導(dǎo)周圍神經(jīng)功能性再生的主要成份；③構(gòu)建技術(shù)：使種子細(xì)胞或蛋白與支架完美結(jié)合，使它們的作用能夠最大化，并最終替代缺失的組織。
　　本研究以I型膠原和明膠為主要原料，并加入納米銀顆粒，通過(guò)冷凍干燥技術(shù)制備具有軸向排列微管結(jié)構(gòu)的納米銀――膠原蛋白支架材料。微管直徑在20—80μm，使其不僅在組成成份上，更在三維結(jié)構(gòu)上高度仿生神經(jīng)。這種軸向排列的微管結(jié)構(gòu)，有利于引導(dǎo)再生軸突定向生長(zhǎng)。材料

3、內(nèi)部均勻分布的納米銀顆粒在濕潤(rùn)的體內(nèi)環(huán)境中表面攜帶正電荷，可以直接和神經(jīng)細(xì)胞表面帶負(fù)電的基團(tuán)相互作用，有利于神經(jīng)細(xì)胞的黏附。同時(shí)正電荷離子還可以吸附細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在材料內(nèi)表面均勻分布，以模擬雪旺細(xì)胞基底膜對(duì)神經(jīng)再生的引導(dǎo)作用，從而加速外周神經(jīng)在支架中的修復(fù)再生過(guò)程。
　　實(shí)驗(yàn)第一部分是使用I型膠原和明膠為支架原料，與不同濃度納米銀溶液混合，通過(guò)冰凍干燥技術(shù)制得多組納米銀――膠原蛋白支架。通過(guò)掃描電鏡觀察其內(nèi)部孔徑排列和機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試

4、，選取最具有仿生結(jié)構(gòu)和具有較強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度的納米銀――膠原蛋白支架。將最優(yōu)納米銀含量的膠原蛋白支架分別在體內(nèi)進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)和銀顆粒蓄積毒性的實(shí)驗(yàn)，在體外進(jìn)行抗菌性實(shí)驗(yàn)。以證明納米銀――膠原蛋白支架具有良好的抗菌性能及無(wú)細(xì)胞毒性和無(wú)體內(nèi)蓄積毒性。結(jié)果證實(shí)：
　　1．通過(guò)冷凍干燥技術(shù)制備的納米銀――膠原蛋白支架為圓柱狀，其中當(dāng)納米銀濃度在0～4mg/ml之間支架材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)較為理想。掃描電鏡觀察橫切面顯示微管內(nèi)徑較均一，孔徑在20～80微米

5、，為軸向平行排列，與周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)相似，可以為神經(jīng)軸突的再生提供仿生引導(dǎo)通道。而當(dāng)納米銀溶液濃度大于4mg/ml時(shí)，支架材料內(nèi)部微管直徑不均勻，并伴隨有大量實(shí)心部分的出現(xiàn)，不能為神經(jīng)軸突的穿行提供仿生的微環(huán)境。
　　2．使用含不同濃度納米銀（0～4mg/ml）的納米銀――膠原蛋白支架進(jìn)行微拉伸強(qiáng)度測(cè)試。結(jié)果含不同濃度納米銀的膠原蛋白支架在充分浸濕的情況下均能抵抗一定強(qiáng)度的拉伸力。根據(jù)拉伸強(qiáng)度公式：微拉伸強(qiáng)度（MPa）=最大斷裂載荷（

6、N）/材料橫截面積（mm2）計(jì)算各濃度組支架材料的拉伸強(qiáng)度。其中含納米銀濃度為（0～2mg/ml）的膠原蛋白支架抗拉伸強(qiáng)度無(wú)顯著差異，達(dá)到0.212～0.22MPa。而其余濃度組抗拉伸強(qiáng)度隨納米銀含量的增加而明顯下降。
　　3．將4組含不同濃度納米銀（0～2mg/ml）的膠原蛋白支架制成薄膜狀貼覆于96孔板底面，每組10孔。對(duì)照組10孔不添加。將雪旺細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板。使用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每日吸光度值，以時(shí)間為橫

7、軸，光吸收值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示4組實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)曲線在各觀察時(shí)間點(diǎn)基本重合。證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)明顯差異，納米銀所含濃度不同均對(duì)雪旺細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。
　　4．按照瓊脂篩選平板法將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌落以0.5麥?zhǔn)蠁挝辉诤Y選平皿上進(jìn)行點(diǎn)種，后將2實(shí)驗(yàn)組納米銀――膠原蛋白支架（含納米銀分別為2mg/ml和1mg/ml）與不含納米銀的普通膠原蛋白支架分別貼覆在平皿中心，置于37

8、℃培養(yǎng)箱中孵育24h后觀察發(fā)現(xiàn)2mg/ml組的納米銀――膠原蛋白支架周圍均明顯存在抑菌環(huán)，證明2mg/ml組納米銀――膠原蛋白支架對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用。1mg/ml組納米銀――膠原蛋白支架和不含納米銀的膠原蛋白支架沒(méi)有顯示出抑菌作用。根據(jù)以上研究結(jié)果，認(rèn)為納米銀――膠原蛋白支架抑菌能力隨支架中納米銀濃度的增加而提高，含2mg/ml納米銀的納米銀――膠原蛋白支架是最理想的外周神經(jīng)再生支架。
　　5．

9、8只大鼠被隨即分成兩組，將實(shí)驗(yàn)組納米銀――膠原蛋白支架（含納米銀2mg/ml）與對(duì)照組膠原蛋白支架（不含納米銀）共24根每組12根分別稱重后植入大鼠皮下，每只3根。每間隔一個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各處死大鼠一只，并取出兩組共6根支架材料通過(guò)掃描電鏡觀察支架在體內(nèi)的降解情況。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組降解過(guò)程極為相似。在植入大鼠皮下一個(gè)月后支架內(nèi)部部分管壁降解，局部融合成粗大的管腔。兩個(gè)月后更多的管壁發(fā)生降解。三個(gè)月后，內(nèi)部降解的更為明顯，

10、失去內(nèi)部結(jié)構(gòu)支撐的支架材料部分發(fā)生塌陷。四個(gè)月后支架材料結(jié)構(gòu)不再完整，僅余殘存。將每觀察日殘存支架干燥稱重，實(shí)驗(yàn)組四個(gè)月中殘存支架分別為初期重量的79.2％、59.9％、38.3％和12.3％，對(duì)照組四個(gè)月中殘存支架重量分別為初期的76.9％、51.4％、33.7％和10.1％。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組的膠原蛋白支架都可以完全降解，實(shí)驗(yàn)組納米銀――膠原蛋白支架降解速度略慢于對(duì)照組。無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組膠原支架均可以滿足神經(jīng)再生臨時(shí)支架的

11、需要。
　　6．使用納米銀――膠原蛋白支架（含納米銀2mg/ml）通過(guò)橋接手術(shù)植入大鼠坐骨神經(jīng)兩斷端共2組每組6只共12只，每間隔一月處死兩實(shí)驗(yàn)組大鼠各兩只，取腦、脊髓、肝和腎通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)銀溶液對(duì)比，觀察發(fā)現(xiàn)三個(gè)觀察日所取大鼠組織器官均不含銀成分，納米銀――膠原蛋白支架被證實(shí)隨材料降解而釋放的銀顆粒不具有造成蓄積毒性的可能。
　　實(shí)驗(yàn)的第二部分：使用對(duì)神經(jīng)再生具有促進(jìn)作用的層粘連蛋白和纖維連接蛋白

12、通過(guò)靜電吸附的作用與納米銀――膠原蛋白支架結(jié)合，使用吸附了細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的納米銀――膠原蛋白支架修復(fù)兔及大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，結(jié)果證實(shí)：
　　1．納米銀在膠原蛋白支架內(nèi)部分布均勻；
　　2．層粘連蛋白在不含納米銀的膠原蛋白支架內(nèi)部分布不均勻，大量成晶體狀聚集，甚至局部堵塞微管腔，不利于外周神經(jīng)的再生。在納米銀――膠原蛋白支架內(nèi)部，層粘連蛋白均勻貼覆在微管壁上，沒(méi)有晶體狀聚集，可以更好的模擬神經(jīng)再生時(shí)的微環(huán)境；
　　

13、3．使用層粘連蛋白復(fù)合過(guò)的納米銀――膠原蛋白支架修復(fù)兔坐骨神經(jīng)10mm缺損，30d后通過(guò)電生理和透射電鏡等檢驗(yàn)方法證實(shí)坐骨神經(jīng)通過(guò)神經(jīng)支架的引導(dǎo)作用已經(jīng)部分成功修復(fù)。修復(fù)效果與自體移植組相比較效果相近，明顯優(yōu)于不含納米銀的膠原蛋白支架組。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)吸附了層粘連蛋白的膠原蛋白支架內(nèi)部微管結(jié)構(gòu)可以部分的模擬雪旺細(xì)胞基底膜的組成從而對(duì)外周神經(jīng)的再生具有明顯的促進(jìn)作用。
　　4．纖維連接蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一同樣在神經(jīng)的再生過(guò)

14、程中扮演著重要的角色。根據(jù)層粘連蛋白與纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)將這兩種蛋白分層覆蓋在納米銀――膠原蛋白支架內(nèi)部微管壁上。使用這種支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損30d可以部分恢復(fù)功能。與對(duì)照組自體神經(jīng)移植相比較修復(fù)效果極為近似。層粘連蛋白和纖維連接蛋白共同黏附膠原蛋白支架可以進(jìn)一步仿生神經(jīng)再生過(guò)程中雪旺細(xì)胞的重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了納米銀顆粒在膠原蛋白支架中通過(guò)靜電吸附作用可以將對(duì)神經(jīng)再生具有重要作用的層粘連蛋白均勻吸附，這使得支