神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植修復犬外周神經(jīng)缺損的應用基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究背景和意義：外周神經(jīng)損傷是臨床常見損傷，外周神經(jīng)缺損的修復是世界性的難題，主要是神經(jīng)生長速度慢和效應器、感受器萎縮快的矛盾。如何提高神經(jīng)再生的速度和質(zhì)量，尋找新的修復方法是外周神經(jīng)損傷迫切需要解決的瓶頸問題。目前外周神經(jīng)缺損的治療策略，是依據(jù)外周神經(jīng)損傷再生的理論，通過提供一個神經(jīng)纖維再生通道、營造有利于神經(jīng)纖維再生微環(huán)境等，涉及神經(jīng)導管及細胞因子的應用、細胞或神經(jīng)移植、以及近年來興起的組織工程化外周神經(jīng)等。這些治療方法已經(jīng)在動物實

2、驗或臨床上取得了可喜的效果，但由于神經(jīng)生長速度較慢，效應器的退化較為嚴重，用于修復長距離神經(jīng)缺損效果不滿意。鑒于此，我們提出了“橋接神經(jīng)元修復外周神經(jīng)缺損”的設(shè)想，即通過神經(jīng)元接力的方法，加快神經(jīng)到達效應器、感受器的時間，減少效應器、感受器病變程度，提高神經(jīng)損傷修復的效果。為驗證此設(shè)想，本研究從臨床實用出發(fā)，擬以骨髓源性神經(jīng)組織定向干細胞(NTCSC)源性神經(jīng)元細胞為種子細胞、以同種異體脫細胞神經(jīng)支架為支架材料，構(gòu)建神經(jīng)元性組織工程化神

3、經(jīng)，用于修復犬坐骨神經(jīng)損傷，探討神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)修復外周神經(jīng)的機制及效果，旨在為外周神經(jīng)缺損的修復提供一個新的方法。
　　 第一部分NTCSC的培養(yǎng)、誘導分化及鑒定
　　 研究目的：研究骨髓源性神經(jīng)組織定向干細胞(NTCSC)的分離、培養(yǎng)、鑒定及向神經(jīng)元細胞的誘導分化，探討作為神經(jīng)元細胞來源種子細胞的可能性。
　　 研究方法：取beagle犬自體骨髓，全骨髓培養(yǎng)，留取貼壁細胞，添加BFGF和EGF的無血清培

4、養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞聚集呈球狀時，吹打散開后傳代培養(yǎng)擴增，細胞鑒定。分別用RA+SHH和NRG1誘導分化，觀察誘導細胞形態(tài)、生長情況，檢測其表面標志。
　　 結(jié)果：傳代細胞懸浮、球形生長、增殖能力旺盛、Nestin陽性，為骨髓源性神經(jīng)組織定向干細胞。RA+SHH誘導分化后，神經(jīng)球貼壁、分散、β-Tubulin陽性、NeuN陽性，為神經(jīng)元樣細胞。NRG1誘導后，神經(jīng)球散開、長出較長的突起、表達S-100，為雪旺氏細胞。
　　

5、 結(jié)論：NTCSC擴增能力強、有神經(jīng)系細胞的特性、易于向神經(jīng)元樣細胞以及雪旺氏細胞分化，是較為理想的神經(jīng)元細胞來源的種子細胞。
　　 第二部分神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的的構(gòu)建。
　　 研究目的：研究脫細胞支架制備、組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建，制備神經(jīng)元性組織工程化外周神經(jīng)移植體。
　　 研究方法：取Beagle犬坐骨神經(jīng)6cm，修剪、0.3％SDS脫細胞5天、RNA酶和DNA酶消化2天、蒸餾水反復漂洗5天、密封、60C

6、o輻照滅菌、4℃保存。將誘導的雪旺氏細胞和神經(jīng)元樣細胞按照1∶1的比例混合成細胞懸液，用微量注射器種植到支架中，制成神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體。
　　 結(jié)果：大體觀察見脫細胞神經(jīng)支架外形完整，乳白色，H-E染色未見到細胞成分，纖維連續(xù)無斷裂。組織工程化神經(jīng)移植體柔軟、飽滿，種植細胞在支架內(nèi)生長，遷移、分布均勻。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了神經(jīng)元性組織工程化外周神經(jīng)移植體。
　　 第三部分神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)的體內(nèi)

7、研究
　　 研究目的：研究神經(jīng)元性組織工程化外周神經(jīng)移植修復坐骨神經(jīng)6cm缺損的效果，探討橋接神經(jīng)元修復外周神經(jīng)長段缺損的可行性。
　　 研究方法：制備犬雙坐骨神經(jīng)6cm缺損模型6只，神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)、雪旺氏細胞性組織工程化神經(jīng)和自體神經(jīng)分別移植到相應的犬4側(cè)缺損的坐骨神經(jīng)上。術(shù)后進行動物行為學觀察。術(shù)后13周，三組犬進行肌電圖檢測。4側(cè)神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植組行辣根過氧化物酶逆行追蹤；全部動物處死、取坐骨神經(jīng)

8、、切片、免疫組織化學染色、甲苯胺藍染色、透射電鏡檢測；取腓腸肌、檢測蛋白質(zhì)的含量。
　　 結(jié)果：術(shù)后犬下肢不能活動，自術(shù)后2周始，三組犬均出現(xiàn)下肢肌肉萎縮、足底潰瘍。術(shù)后8周，神經(jīng)元性組織工程化外周神經(jīng)移植犬對針刺有反應、下肢能觸地行走，自體神經(jīng)移植組術(shù)后10周恢復感覺運動功能，雪旺氏細胞性組織工程化神經(jīng)移植組術(shù)后13周恢復感覺運動功能。肌電圖檢測表明：神經(jīng)元性組織工程神經(jīng)恢復效果理想。
　　 神經(jīng)元性組織工程化外周神經(jīng)

9、移植犬腓腸肌中注射HRP后，神經(jīng)移植體內(nèi)可見天青色的團塊。免疫組織化學顯示，神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體中NeuN陽性。甲苯胺藍染色，神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體中髓鞘數(shù)量多于雪旺氏細胞性組織工程化神經(jīng)移植組。透射電鏡顯示神經(jīng)元性組織工程化神經(jīng)移植體中有突觸的形成。考馬斯亮藍檢測腓腸肌蛋白質(zhì)含量，實驗組＞自體神經(jīng)移植組＞雪旺氏細胞移植組。
　　 結(jié)論：種植的干細胞源性神經(jīng)元樣細胞可以在外周神經(jīng)微環(huán)境內(nèi)存活、并維持神經(jīng)元的功能，橋