組織工程神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究.pdf

1、一、骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、生物學(xué)特性及向類雪旺細胞誘導(dǎo)分化。
　　 目的：掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和擴增的方法，并探討其生物學(xué)特性及向類雪旺細胞分化的條件。
　　 方法：無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨和胸骨，并用吸取D-Hank’s液的注射器沖出骨髓細胞，置于含10％FBS、100U/ml雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2環(huán)境下進行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進行純化。待細胞達95％

2、融合時，用0.125％的胰酶-0.02％的EDTA消化2-3min后進行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細胞生長特點。用MTT法測定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生長曲線，從而進一步了解其生長特性。將骨髓間充質(zhì)干細胞按順序分別加入β-巰基乙醇、全反式視黃酸、Forskolin、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子-AA向類雪旺細胞進行誘導(dǎo)，在倒置顯微鏡下觀察生長情況及誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)變化，S-100、GFAP免疫細胞化學(xué)染

3、色并計算其陽性率，Western-blot法檢測S-100、GFAP蛋白的表達。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示原代細胞1-2天開始有少量細胞貼壁，形狀不規(guī)則，呈梭形成纖維樣細胞形態(tài)，7-9天左右細胞可長滿培養(yǎng)瓶底，達95％以上融合，呈漩渦狀，輻射狀或魚群樣排列。傳代后2h后部分細胞即開始貼壁，24h內(nèi)即可完全貼壁，6-7天可鋪滿培養(yǎng)瓶底。傳代10代以上，各代之間細胞生長均一，穩(wěn)定。P2、P4、P6細胞生長曲線基本相同，分為潛伏期（第

4、1-2天）、對數(shù)生長期（第3-5天）和平臺期（第6-7天），且?guī)状毎g生長狀況穩(wěn)定。依次加入誘導(dǎo)劑后部分細胞向雪旺細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，胞體呈橢圓形，有2-3個纖細的細胞突起，成縱形柵欄狀排列，免疫細胞化學(xué)染色S-100和GFAP表達陽性率分別為71.34％和68.32％，Western-blot檢測有S-100，GFAP表達，未誘導(dǎo)細胞則不表達。
　　 結(jié)論：1應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離法成功建立了一種體外簡單、快速的分離、純化大

5、鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，并使其在體外迅速得到了增殖，而且性狀穩(wěn)定。2大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為類雪旺細胞。
　　 二、羊膜脫細胞基質(zhì)的制備及生物相容性的研究
　　 目的：通過去污劑和酶消化法進行羊膜脫細胞基質(zhì)的制備，并觀察其作為組織工程支架材料的生物相容性。
　　 方法：取新鮮人羊膜沖洗后以1％tritonX-100溶液振蕩24 h，0.25％胰蛋白酶37℃振蕩4 h，充分漂洗，干燥后環(huán)氧乙烷消

6、毒，并進行蘇木精-伊紅染色和掃描電鏡檢測，皮下埋置實驗檢測其組織相容性。四甲基偶氮唑鹽法測定羊膜脫細胞基質(zhì)浸提液對類雪旺細胞毒性。取培養(yǎng)的類雪旺細胞復(fù)合培養(yǎng)于羊膜脫細胞基質(zhì)上，倒置顯微鏡下觀察生長情況，并進行蘇木精.伊紅檢測。
　　 結(jié)果：制備的羊膜脫細胞基質(zhì)為白色菲薄、半透明的膜狀物，柔韌性好，經(jīng)蘇木精-伊紅和掃描電鏡檢測無細胞殘留。皮下埋置實驗檢測其組織相容性好。羊膜脫細胞基質(zhì)浸提液對類雪旺細胞毒性評分為1級，復(fù)合培養(yǎng)后可見

7、羊膜脫細胞基質(zhì)表面細胞黏附生長良好，細胞伸展，形態(tài)與正常培養(yǎng)細胞無差異。
　　 結(jié)論：經(jīng)去污劑和酶消化法制備的羊膜脫細胞基質(zhì)生物相容性良好，是一種理想的組織工程支架材料。
　　 三、類雪旺細胞復(fù)合羊膜脫細胞基質(zhì)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究
　　 目的：探討應(yīng)用類雪旺細胞及羊膜脫細胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程化神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗效果，為臨床研究提供資料。
　　 方法：以類雪旺細胞為種子細胞，羊膜脫細胞基

8、質(zhì)為支架材料，體外復(fù)合培養(yǎng)后構(gòu)建組織工程化神經(jīng)來修復(fù)大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損。術(shù)后12周，通過大體觀察、電生理檢測、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、逆行示蹤及圖像分析等多方面分析評價修復(fù)效果。
　　 結(jié)果：術(shù)后12周，實驗組患肢潰瘍基本愈合，移植段與近、遠坐骨神經(jīng)直徑相當。組織學(xué)檢查示含有大量的有髓神經(jīng)纖維，且髓鞘較厚。透射電鏡見再生神經(jīng)纖維呈較成熟形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，髓鞘板層清晰。電生理功能檢測、逆行示蹤檢測被HRP標記的神經(jīng)元及圖像分析與自體神經(jīng)

9、移植組相比無顯著差異。
　　 結(jié)論：類雪旺細胞復(fù)合羊膜脫細胞基質(zhì)構(gòu)建的組織工程化人工神經(jīng)可以成功修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損，其效果接近于自體神經(jīng)移植。
　　 四、創(chuàng)傷性腦組織勻漿對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞的影響
　　 目的：觀察創(chuàng)傷后24 h和正常腦組織勻漿誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的差別。
　　 方法：采用Gruncr改良法制作中度腦損傷大鼠模型，取傷后24 h和正常大鼠腦組織勻

10、漿，對體外培養(yǎng)的第3代骨髓間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測細胞內(nèi)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的表達，比較創(chuàng)傷后和正常腦組織勻漿兩組誘導(dǎo)率差別。
　　 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)創(chuàng)傷性腦組織勻漿培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h后，細胞的胞體變大，36 h后部分細胞分化，回縮成圓形或梭形，48 h后部分細胞可見兩個或多個突起伸出，類似神經(jīng)元。免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測顯示，創(chuàng)傷性腦組織勻漿培養(yǎng)基誘導(dǎo)組神經(jīng)元特異性