應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建立體尿道的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探索兔陰莖海綿體平滑肌(CCSMCs)細(xì)胞的純化培養(yǎng)技術(shù)及純度鑒定方法。
　　 方法：取雄性新西蘭兔新鮮的陰莖組織,利用高濃度的膠原酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)對(duì)海綿體平滑肌細(xì)胞進(jìn)行純化培養(yǎng)。獲得CCSMCs后運(yùn)用MTT分析細(xì)胞生長特性,平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)、肌球蛋白(Myosin)、結(jié)蛋白(Desmin)免疫熒光鑒定海綿體平滑肌細(xì)胞。同期兔脂肪干細(xì)胞作為對(duì)照參考。流式細(xì)胞儀檢測P2及P5代細(xì)胞α-SM-ac

2、tin、Myosin、Desmin陽性率變化情況。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)細(xì)胞MTT顯示細(xì)胞指數(shù)增長期為6天左右,隨后進(jìn)入平臺(tái)期。α-SM-actin、Myosin、Desmin均呈陽性反應(yīng),同期脂肪干細(xì)胞僅α-SM-actin顯示陽性結(jié)果。第2代細(xì)胞表達(dá)α-SM-actin、Myosin、Desmin陽性率分別65.3％,42.2％,62.3％。通過純化技術(shù)至第5代時(shí),上述指標(biāo)陽性表達(dá)率分別上升為92.8％,72.7％,78.1％.

3、
　　 結(jié)論：通過高濃度的酶消化法及差速貼壁技術(shù)可獲得高純度的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞,完全符合組織工程及其它基礎(chǔ)研究的要求。而Myosin、Desmin相對(duì)于α-SM-actin更應(yīng)成為鑒定CCSMCs的特異性指標(biāo)。
　　 第二部分
　　 目的:評(píng)估應(yīng)用于尿道修復(fù)重建的多種生物材料的力學(xué)特性及生物相容性。
　　 方法：脫細(xì)胞法制備小腸黏膜下層組織(SIS),膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(BAMG)以及脫細(xì)胞尿道海綿體(A

4、CSM),同時(shí)編織法制備PGA支架。單軸拉伸測試測定各類支架生物力學(xué)特性,光鏡及掃描電鏡法測定支架表面孔徑大小。線粒體代謝活性法(MTT)檢測各種生物材料的細(xì)胞毒性。所有支架表面接種海綿體平滑肌細(xì)胞(CCSMCs),體外培養(yǎng)14天后進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞滲透情況。
　　 結(jié)果：生物力學(xué)評(píng)估顯示ACSM在彈性模量以及斷裂強(qiáng)度方面的檢測結(jié)果明顯由于其余材料(p<0.05).MTT的結(jié)果顯示所有的支架材料均支持正常的細(xì)胞生長代謝,并未發(fā)現(xiàn)存在

5、有明顯的細(xì)胞毒性。PGA在掃描電鏡中顯示出最大的孔徑(>200μm).同時(shí)ACSM的尿道面(<5μm)和海綿體面(>10μm)觀察到明顯不同的孔徑大小。細(xì)胞接種14天以后PGA材料的內(nèi)部可見種子細(xì)胞的廣泛分布。在BAMG以及ACSM的尿道面可見有多層的上皮細(xì)胞層的形成,但沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞滲透跡象。而SIS和ACSM的海綿體面觀察到明顯的細(xì)胞滲透生長表現(xiàn)。
　　 結(jié)論：所有支架材料在本研究中顯示出良好的生物相容性,同時(shí)在力學(xué)特

6、性方面也與正常尿道組織相仿。但ACSM在力學(xué)和組織學(xué)的諸多參數(shù)上具有一定的優(yōu)越性,其可在將來成為組織工程尿道修復(fù)重建材料的新選擇之一。
　　 第三部分
　　 目的:探討及優(yōu)化體外構(gòu)建三維立體尿道組織的復(fù)合技術(shù)。
　　 方法：高速振蕩脫細(xì)胞法制備脫細(xì)胞尿道海綿體(ACSM),碘消毒法進(jìn)行復(fù)合前消毒,酶消化法分離及擴(kuò)增兔舌黏膜上皮細(xì)胞和海綿體平滑肌細(xì)胞。采用三種復(fù)合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞與支架材料的復(fù)合:A組(三明治復(fù)合組)、

7、B組(注射復(fù)合組)、C組(動(dòng)態(tài)復(fù)合組)。體外培養(yǎng)14天以后行HE染色以檢查復(fù)合效果。
　　 結(jié)果：振蕩脫細(xì)胞處理后ACSM的結(jié)構(gòu)較脫細(xì)胞前更為疏松；碘消毒法在徹底消毒的同時(shí)能夠最大限度的保留脫細(xì)胞支架的原有結(jié)構(gòu)。復(fù)合支架體外培養(yǎng)14天后HE染色均可見有完整的上皮細(xì)胞層形成于支架表面。A組復(fù)合后平滑肌細(xì)胞僅在支架大間隙中可見,未見向深部浸潤趨勢(shì)。B組復(fù)合后平滑肌細(xì)胞成團(tuán)分布于支架內(nèi),并受周圍支架組織約束成局限化表現(xiàn)。C組HE染色可

8、見平滑肌細(xì)胞均勻分布于支架內(nèi)部并與支架表面的上皮細(xì)胞層分界清晰。
　　 結(jié)論：高速振蕩法制備的支架組織具有理想的三維空間結(jié)構(gòu),結(jié)合動(dòng)態(tài)細(xì)胞復(fù)合技術(shù)可構(gòu)建擁有良好立體結(jié)構(gòu)的尿道組織。
　　 第四部分
　　 目的:探討構(gòu)建三維立體尿道以及利用其進(jìn)行尿道修復(fù)重建可行性
　　 方法：制備脫細(xì)胞尿道海綿體支架(Acellular corpus spongiosummatrices,ACSM),并利用單軸力學(xué)拉伸測試

9、進(jìn)行相關(guān)的生物力學(xué)特性檢測。采用動(dòng)一靜態(tài)復(fù)合技術(shù)將實(shí)驗(yàn)兔自體海綿體平滑肌細(xì)胞(CCSMCs)以及舌黏膜上皮細(xì)胞接種于ACSM上。體外培養(yǎng)14天后6只實(shí)驗(yàn)兔采用上述材料進(jìn)行尿道缺損模型的修補(bǔ)(C組),另6只實(shí)驗(yàn)兔采用單純復(fù)合舌黏膜上皮細(xì)胞的支架進(jìn)行尿道重建(B組),剩余6只實(shí)驗(yàn)兔作為對(duì)照組接受單純支架材料的尿道重建(A組)。實(shí)驗(yàn)兔分別于術(shù)后1、2、6月處死,處死前均接受逆行尿道造影的評(píng)估,同時(shí)進(jìn)行H&E染色以及相關(guān)免疫組化染色研究。

10、>　　 結(jié)果：ACSM在力學(xué)檢測過程中體現(xiàn)出優(yōu)于正常尿道組織的生物力學(xué)特性(p<0.05)。經(jīng)過14天體外培養(yǎng)后,復(fù)合支架表面可以見到有1-2層上皮細(xì)胞生長,同時(shí)CCSMCs可以見到分布于支架材料的內(nèi)部。動(dòng)物回植實(shí)驗(yàn)中,C組的實(shí)驗(yàn)兔在研究的全過程中始終保持著管腔的通暢,但在A和B組中發(fā)現(xiàn)明顯的尿道狹窄跡象。組織學(xué)研究中A組實(shí)驗(yàn)兔在6月時(shí)所獲取的尿道可以很清晰看見有明顯的纖維化以及炎癥反應(yīng)。在B組的切片觀察中僅可見層數(shù)極少的上皮細(xì)胞層形