谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及其抑制劑在宮頸癌化療中的作用.pdf

1、背景與目的:
　　 宮頸癌治療根據(jù)患者的臨床分期、年齡、一般情況、腫瘤相關(guān)因素等決定治療方案[26]。宮頸癌早期(Ⅰ～ⅡA期)主要采用手術(shù)治療，巨塊型4cm的宮頸癌(Ⅰ)B2及ⅡA期的患者術(shù)前采用新輔助化療后手術(shù)，局部晚期宮頸癌(ⅡB～ⅢB期)目前采用放化療同步治療，晚期(Ⅳ期)多采用化療加放療[94,95]。近年來，由于聯(lián)合化療的進(jìn)展，宮頸癌的化療也從對(duì)晚期復(fù)發(fā)癌的姑息治療變成宮頸癌綜合治療的重要組成部分。尤其是新輔助化療因其

2、能夠縮小局部腫瘤體積、清除或抑制亞臨床轉(zhuǎn)移灶、提高后續(xù)治療的效果，受到日益廣泛的關(guān)注。然而，即使理想的手術(shù)、放療、化療等多種方式聯(lián)合治療，Ⅲ、ⅣA宮頸癌患者5年無病生存率不到一半?；熕幬锬退幨侵型砥趯m頸癌治療失敗的主要原因。引起藥物耐藥的原因是多因素的，包括避免凋亡細(xì)胞死亡，改變多種藥物耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變藥物代謝或吸收，和/或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶過表達(dá)。
　　 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferas，G

3、STs)是一個(gè)同源二聚體酶的超基因家族，為重要的Ⅱ相代謝酶，其主要功能是催化谷胱甘肽和化療藥物、致癌物、環(huán)境污染物等一系列外來物結(jié)合，增加代謝產(chǎn)物水溶性，促進(jìn)其排出，達(dá)到解毒功能。臨床應(yīng)用的許多抗癌藥物，如順鉑、阿霉素、卡氮芥、絲裂霉素等都是GSTs的底物。GSTs基因多態(tài)性可導(dǎo)致酶活性降低或喪失，從而增高宿主對(duì)某些毒物和致癌物作用的敏感性，增加細(xì)胞毒作用。藥理遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究表明，GSTs基因多態(tài)性與乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌

4、的發(fā)生和化療耐藥相關(guān)。
　　 Townsend等的研究顯示GSTs在腫瘤組織中高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種化療藥物耐藥，提示GST在原發(fā)及繼發(fā)性耐藥中發(fā)揮重要的作用。體外活體實(shí)驗(yàn)顯示，化療影響GSTsmRNA表達(dá)水平。Huang等的研究顯示骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)DXR或順鉑(DDP)處理后，GSTP1表達(dá)上調(diào)。GSTP1過表達(dá)引起細(xì)胞對(duì)DXR和DDP耐藥。GSTP1抑制引起細(xì)胞凋亡和DNA損傷更明顯[24]。人胃腸道癌細(xì)胞暴露于5-FU或CDD

5、P，引起TS、GST-pi和DPDmRNA的表達(dá)上調(diào)，上調(diào)程度與藥物耐藥相關(guān)[91]。目前，對(duì)化療對(duì)GSTmRNA表達(dá)的影響集中于GSTπ，而對(duì)GSTT1、GSTM1mRNA表達(dá)的影響尚未見報(bào)道GSTs抑制劑已經(jīng)形成，并用于調(diào)節(jié)GSTs高表達(dá)的實(shí)體腫瘤化療耐藥的調(diào)節(jié)。其中利尿酸(ethacrynicacid，EA)是GSTs抑制劑的重要代表藥。
　　 至今為止，唯一的GSTs與宮頸癌化療相關(guān)的報(bào)道是SohY等的研究。他們對(duì)12例

6、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌患者化療前后GSTπ表達(dá)進(jìn)行了觀察，盡管他們的研究顯示化療后GSTπ表達(dá)陽性與預(yù)后差相關(guān)，但由于樣本例數(shù)過小而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[65]。因此，GSTs基因多態(tài)性及化療對(duì)GSTsmRNA表達(dá)的影響和GSTs及其抑制劑在宮頸癌化療耐藥中的作用尚不明確。本研究通過對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和GSTs基因分型，檢測GSTsmRNA表達(dá)，使用化療藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察化療對(duì)GSTsmRNA表達(dá)的影響;同時(shí)采用化療藥物阿霉素(DXR)、長

7、春新堿(VCR)和GSTs抑制劑EA對(duì)宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察藥物對(duì)細(xì)胞生長和存活，旨在分析GST基因多態(tài)性及化療對(duì)GSTsmRNA表達(dá)的影響，和GSTs及其抑制劑在宮頸癌化療反應(yīng)中的作用。
　　 材料和方法:
　　 1.宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 Hela、Siha、C-33A為宮頸癌細(xì)胞，貼壁生長;Siha、C-33A培養(yǎng)于含10％FBS、1％谷氨酞胺的DMEM培養(yǎng)基中;Hela培養(yǎng)于含10％FBS、1％谷氨酞胺的

8、RPMI-1640培養(yǎng)基中;所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均于37℃、5％CO2、濕度為95％培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2.細(xì)胞GSTs基因分型
　　 抽提細(xì)胞DNA，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別識(shí)別GSTM1/GSTT1野生型和空白等位基因，獲得GSTT1/GSTM1完整的基因分型(GSTT1/M1+/+、+/-、-/-);測序分析GSTP1基因序列，使用SequenceScannerSoftwarev1.0分析序列圖，確定GSTP1

9、基因型(Ile105Ile、Ile105Val、Val105Val)。
　　 3.RT-PCR檢測GSTsmRNA表達(dá)
　　 抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用GSTs特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
　　 4.熒光定量PCR檢測GSTsmRNA表達(dá)
　　 抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參，以SYBGREEN為染料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過相對(duì)定量以2-Δ

10、Ct值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。
　　 5.化療藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞株體外生長的抑制作用
　　 化療藥物的細(xì)胞毒作用采用MTS分析方法檢測。在確定每孔合適的細(xì)胞數(shù)目和藥物濃度后，將Hela、Siha、C-33A以每孔細(xì)胞數(shù)分別為1.5×103、4×103、1×104接種于96孔板中，每孔細(xì)胞懸液體積50μl。次日上午待細(xì)胞貼壁后加藥，每孔藥液體積50ul，共100ul，每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組（培養(yǎng)基、MTS），

11、對(duì)照組（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTS）。分別培養(yǎng)0、24、48和72小時(shí)。每孔中加MTS20ul，于37℃、5％CO2、濕度95％的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4小時(shí)。酶標(biāo)儀OD490nm處測量各孔的吸光值(OD值)，以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。
　　 6.化療對(duì)GSTsmRNA表達(dá)的影響
　　 采用DXR處理細(xì)胞Hela、C-33A，分別在加藥后24、48小時(shí)后收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測GSTsmRN

12、A表達(dá)。根據(jù)不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)構(gòu)成5組，分別為對(duì)照組、低濃度24小時(shí)組（L24組）、高濃度24小時(shí)組（H24組）、低濃度48小時(shí)（L48組）、高濃度48小時(shí)組(H48組)。對(duì)照組不加任何藥物;低濃度組藥物濃度為DXR0.2uM;高濃度組藥物濃度為DXR1uM。在藥物作用24、48小時(shí)后，收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測GSTsmRNA的表達(dá)。
　　 7.EA對(duì)DXR、VCR細(xì)胞毒作用的影響
　　 細(xì)胞分為4組:空白對(duì)照組

13、、DXR或VCR單藥組、EA單藥組、EA+DXR或VCR組。對(duì)照組不加任何藥物。每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)定空白組。加藥后每孔的終體積為100ul。于37℃、5％CO2、濕度95％的培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、24、48、72小時(shí)。每孔加MTS20ul，酶標(biāo)儀OD490nm處測量各孔的吸光值（OD值），以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用GraphPadPrism5.0軟件計(jì)算IC50值。所

14、有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示。三組及三組以上數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析(ONE-WAYANOVA)分析，如果方差不齊采用Welch方法校正。如差異顯著，進(jìn)一步行多重比較。組間兩兩比較，方差齊采用LSD方法，不齊采用Dunnett'T3方法;兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(2-Independent-samplesT-test)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。當(dāng)P＜0.05時(shí)

15、有顯著性差異。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.GSTs基因分型
　　 1.1PCR分析GSTT1、GSTM1分型
　　 GSTT1野生型等位基因PCR產(chǎn)物大小為114bp，空白等位基因?yàn)?640bp;GSTM1野生型等位基因PCR產(chǎn)物大小為84bp，GSTM1空白等位基因?yàn)?4kb。研究結(jié)果顯示GSTT1野生型等位基因PCR顯示Hela、C33A細(xì)胞都出現(xiàn)了114bp大小目的條帶，Siha細(xì)胞株未出現(xiàn)114

16、bp條帶;GSTT1空白等位基因PCR結(jié)果顯示Hela、Siha出現(xiàn)1460bp大小目的條帶，C-33A未出現(xiàn)條帶;GSTM1野生型等位基因顯示三株宮頸癌細(xì)胞都出現(xiàn)84bp大小目的條帶，GSTM1空白等位基因:除Hela外，Siha、C-33A出現(xiàn)14kb大小目的條帶。由此，得到Hela、Siha、C-33A細(xì)胞株GSTT1基因分型分別為、+/-、-/-、+/+;GSTM1基因分型++/+、+/-、+/-。+/+、+/-、-/-分別代表

17、純合野生型、雜合型、純合性缺失型。
　　 1.2.GSTP1測序結(jié)果
　　 Hela、C-33A313位點(diǎn)堿基為A/G，105位點(diǎn)氨基酸密碼子為ATC/GTC，即Ile105Val;Siha313堿基為A，105位氨基酸密碼子為ATC，即氨基酸Ile，基因型為Ile105Ile。
　　 2.RT-PCR檢測GSTT1、GSTM1、GSTP1mRNA在3種細(xì)胞中的表達(dá)
　　 RT-PCR分析GSTT1結(jié)果顯

18、示Hela、C-33A出現(xiàn)133bp大小目的基因條帶，Siha未檢測到GSTT1mRNA表達(dá);GSTM1結(jié)果顯示Hela可見108bp大小的條帶，Siha、C-33A未檢測到GSTM1mRNA表達(dá)。三株宮頸癌細(xì)胞均表達(dá)GSTP1。
　　 3.熒光定量PCR檢測3種細(xì)胞株GSTs的表達(dá)
　　 熒光定量PCR檢測3種宮頸癌細(xì)胞株GSTs的表達(dá)，結(jié)果顯示即使同樣的基因型，不同細(xì)胞間GSTsmRNA表達(dá)差異很大，更有趣的是一些攜

19、帶雜合型細(xì)胞中檢測不到mRNA的表達(dá)。Siha、C-33A細(xì)胞株同為GSTM1雜合型(+/-)，卻檢測不到GSTM1mRNA表達(dá)。Siha細(xì)胞GSTP1為純合野生型，Hela、C-33A為雜合型，但SihaGSTP1mRNA表達(dá)較Hela、C-33A更低。
　　 4.DXR對(duì)細(xì)胞GSTsmRNA表達(dá)的影響
　　 4.1DXR對(duì)C-33A、Hela細(xì)胞株GSTT1mRNA表達(dá)的影響
　　 采用不同濃度DXR對(duì)C-3

20、3A、Hela處理24、48小時(shí)后，C-33A細(xì)胞株各處理組GSTT1mRNA表達(dá)明顯增加，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=114.277，P＜0.01)。多重比較結(jié)果顯示，四個(gè)處理組中除了H24組與對(duì)照組比較無顯著性差異外(P＞0.05)，其他三個(gè)處理組的GSTT1mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);Hela細(xì)胞株在L48組GSTT1mRNA表達(dá)稍增加外，其余處理組較對(duì)照組表達(dá)量減少。與對(duì)照組比較，H48組顯著低于對(duì)照組(P＜0.

21、05)，其余組間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.2DXR對(duì)C-33A、Hela細(xì)胞株GSTM1mRNA表達(dá)的影響
　　 采用不同濃度DXR對(duì)C-33A、Hela處理24、48小時(shí)后，C-33A細(xì)胞株各處理組GSTM1mRNA表達(dá)明顯增加，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01。與對(duì)照組比較，H24、組L48組、H48組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;L24組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。Hela細(xì)胞L48組GSTM1mR

22、NA較對(duì)照組增加，但差異無顯著性，P＞0.05。L24組、H48組GSTM1mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組，P＜0.05。
　　 4.3DXR對(duì)C-33A、Hela細(xì)胞株GSTP1mRNA表達(dá)的影響
　　 采用不同濃度DXR對(duì)C-33A、Hela處理24、48小時(shí)后，C-33A細(xì)胞株各處理組GSTP1mRNA表達(dá)明顯增加，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=35.24，P=0.001)。與對(duì)照組相比，L24組無顯著性差異(P＞0.05

23、)。H24組、L48組、H48組GSTP1mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，以H48組表達(dá)最高，均顯著高于其他處理組((P＜0.05));H24組、L48組無顯著性差異(P＞0.05);Hela細(xì)胞H24組GSTP1mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，L24組、L48組、H48組表達(dá)量減少，各組間比較有顯著性差異(F=4.34，P=0.027)。與對(duì)照組比較，H24組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其余處理組與對(duì)照組無明顯差異(P

24、＞0.05)。
　　 5.DXR、VCR對(duì)宮頸癌細(xì)胞的抑制作用
　　 DXR、VCR以時(shí)間和濃度依賴模式降低Hela、Siha、C-33A宮頸癌細(xì)胞的生存能力，隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長，DXR、VCR對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用不斷增加。通過GraphPadPrism5.0軟件計(jì)算IC50值，對(duì)藥物IC50進(jìn)行比較。DXR對(duì)三種細(xì)胞抑制作用的IC50分別為0.357±0.133、0.982±0.282、2.052±1.19

25、4uM，三組數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=7.231，P=0.009)。VCR對(duì)三種細(xì)胞抑制作用的IC50分別為5.852±2.502、43.08±9.199、37.958±7.162uM，三組數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=43.3，P＜0.001)。由此可知，攜帶野生型，表達(dá)GSTM1mRNA的Hela細(xì)胞對(duì)DXR、VCR最敏感，而GSTP1、GSTT1mRNA高表達(dá)的C-33A顯示對(duì)藥物不敏感。Siha細(xì)胞株對(duì)DXR較C-33A敏感(P

26、=0.019)，而對(duì)VCR則較C-33A敏感性差，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.297)。
　　 6.EA對(duì)宮頸癌化療療效的影響
　　 EA聯(lián)合DXR、VCR組在24、48、72小時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于DXR、VCR或EA單藥組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同濃度化療藥物處理后，細(xì)胞GSTT1、GSTM1、GSTP1mRNA表達(dá)增加，上調(diào)程度與藥物耐藥相關(guān)。
　　 2.攜帶野