1,3-O,N螺雜環(huán)類乙酰肝素酶抑制劑對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制作用.pdf

1、背景及目的：
　　宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤，隨著細胞學聯(lián)合病毒學篩查機制逐步完善及HPV疫苗的批準使用，子宮頸癌的早期病變得以及時發(fā)現(xiàn)，世界范圍內宮頸癌的發(fā)病率已明顯降低，但在發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率逐漸增高和發(fā)病年輕化的勢頭并沒有得到有效遏制。而晚期、持續(xù)性和復發(fā)性宮頸癌是臨床處理的難點，治療緩解率低，目前主要是采用化療來緩解癥狀，減少腫瘤的負荷。許多臨床研究報告顯示，單一化療藥物不能很好提高患者的總生存率，多藥聯(lián)合化療提

2、高了反應率，但對遠期生存率并沒有顯著地改善。因而，需要開發(fā)不同作用機制的藥物，探索新的治療方法，而分子靶向治療藥物成為人們解決宮頸癌治療困境的重要選擇。
　　腫瘤獲得侵襲與轉移能力依賴的一個重要方面就是基底膜完整性遭到破壞，其中，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）是細胞外基質（ECM）中非結構蛋白的重要組成部分，它由一個核心蛋白通過糖苷鍵和數(shù)個與之共價連接的線性HS側鏈組成，其降解對于腫瘤的侵襲和轉移具有重要的促進作用。乙酰肝素酶（

3、Heparanase,HPA）作為體內唯一存在的內源性糖苷類內切酶，其水解位點正是HSPG中硫酸乙酰肝素（ HS）側鏈與其核心蛋白相連的糖苷鍵，通過調節(jié)HSPG的結構和功能影響生長因子信號轉導和細胞行為，其在許多惡性腫瘤中的高表達使其受到越來越多的關注，成為癌癥治療的分子靶點。在我們課題組之前的一系列研究中已經證實HPA在宮頸癌組織中呈高表達，癌組織轉移淋巴結中的表達也顯著增高，轉移淋巴結中乙酰肝素酶陽性宮頸癌患者預后差。
　　本

4、研究以HPA為中心開發(fā)新的靶點作用分子，設計合成了一系列1,3-O,N螺雜環(huán)類HPA抑制劑，觀察它們對宮頸癌HeLa細胞的體外生長抑制作用和對細胞周期、凋亡及HPA蛋白表達的影響，為宮頸癌HPA靶向抑制治療提供理論支持。
　　材料與方法：
　　通過改變 HS的吡喃糖苷類模擬物 DMBO(2-(2,6-二氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷)上取代基的種類及位置，與鄭州大學化學工程學院合作優(yōu)化設計合

5、成了兩個系列13種新的1,3-O,N螺雜環(huán)類HPA抑制劑；利用乙酰肝素降解檢測試劑盒檢測化合物對 HPA酶活性的抑制作用；復蘇并培養(yǎng)宮頸癌HeLa細胞株，MTT法和細胞劃痕法觀察抑制劑對宮頸癌HeLa細胞的生長和遷移抑制效應；流式細胞技術檢測細胞周期變化和凋亡狀況；細胞免疫化學法檢測細胞HPA蛋白表達水平變化。
　　結果:
　　1. HPA抑制劑對HPA酶活性的影響
　　除22號化合物（2-(2,4-二氟苯基)-5-(

6、4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷）酶抑制作用不明顯外，所檢測的HPA抑制劑均可不同程度地抑制HPA酶活性(IC50值為4.47-47.19μM)，其中抑制作用最好的是14號（2-(2,6-二氟苯基)-5-苯基-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷），其次為16號（2-(2-氟苯基)-5-(4-甲氧基苯基)-1-氧-3-氮螺[5,5]十烷）。
　　2. HPA抑制劑對宮頸癌HeLa細胞的生長抑制作用
　　所檢測的化合

7、物均可抑制HeLa細胞生長(IC50值為48.158-96.641μM)，其中16號抑制劑對HeLa細胞生長抑制作用最強，存在明顯的時間依賴和濃度依賴性，P<0.001。
　　3.化合物16號對HeLa細胞遷移效應的影響
　　與對照組相比，50μM（接近IC50）16號抑制劑處理HeLa細胞24小時后可顯著抑制細胞遷移。
　　4.化合物16號對HeLa細胞周期及凋亡的影響
　　流式細胞術結果顯示：抑制劑處理后使

8、HeLa細胞阻滯在 G0/G1期和 G2/M期；50μM的16號抑制劑作用48小時后細胞凋亡率(（11.93±1.16）％)顯著高于對照組（（6.65±1.81）%），P=0.0131。
　　5.化合物16號對HeLa細胞HPA蛋白表達的影響
　　50μM的16號抑制劑處理細胞后,細胞免疫化學結果顯示處理組細胞爬片乙酰肝素酶蛋白平均光密度值（0.3933±0.0363）顯著低于對照組（0.5000±0.0937）， P=0.