Foxp3在宮頸癌表生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中作用研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌是嚴重危害婦女生命健康的惡性生殖道腫瘤。在發(fā)展中國家，宮頸癌的發(fā)病和病死率均居第二位，并有年輕化傾向。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)持續(xù)感染已被證實作為宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的第一要素。宿主免疫反應(yīng)，特別是細胞免疫反應(yīng)，對控制HPV感染及HPV相關(guān)腫瘤形成發(fā)揮重要作用。Treg細胞是一種免疫負性調(diào)控細胞，可以通過與細胞直接接觸和分泌抑制性細胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。Treg

2、細胞對于維持宿主免疫系統(tǒng)對自身抗體的免疫無應(yīng)答性和抑制過度的免疫反應(yīng)對宿主造成損傷起著不可或缺的作用;另一方面，Treg細胞打破體內(nèi)平衡過表達可能會阻礙機體免疫系統(tǒng)對感染及腫瘤的保護性免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷而促進腫瘤的發(fā)生。
　　CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞具有廣泛的免疫抑制性，通過表面膜分子與其它細胞直接接觸或以分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β等方式，抑制體內(nèi)CD4+Th1細胞等多種免疫細

3、胞的活化和增殖。多種T細胞分子抗原參與Treg的特異性功能效應(yīng)，F(xiàn)oxp3是調(diào)節(jié)性T細胞特異性的表達轉(zhuǎn)錄因子，對Treg細胞的發(fā)育和功能發(fā)揮具有關(guān)鍵作用，特別是Foxp3高表達的Treg具有顯著的免疫抑制效應(yīng)。Tregs功能紊亂（例如，F(xiàn)oxp3基因突變）能夠引起嚴重的自身免疫免疫性疾病，免疫病理學(xué)及變態(tài)反應(yīng)。Foxp3是來源于胸腺以及外周的調(diào)節(jié)性T細胞的標志性分子。Foxp3雖然在除胸腺和脾以外的組織中有較少程度的表達，最新發(fā)現(xiàn)Fox

4、p3可以表達于多種腫瘤細胞，并且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后具有一定的關(guān)系。p16INK4a是HPV整合入宿主細胞的主要標志。p16INK4a的異常表達和HR-HPV感染關(guān)系密切， HPV DNA整合到宿主染色體DNA上是病毒在體內(nèi)穩(wěn)定存在并維持持續(xù)感染的重要形式。p16INK4a與Foxp3之間關(guān)系有待進一步研究。
　　目前關(guān)于Foxp3在宮頸腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道。本課題旨在研究Foxp3在宮頸癌組織中的表達作用

5、情況，比較其與宮頸癌臨床病理特征以及其與p16INK4a的關(guān)系;Foxp3的表達對宮頸癌細胞增殖及侵襲能力的影響及機制，為尋找宮頸癌治療提供新思路。
　　方法：
　　1、應(yīng)用免疫組化方法檢測宮頸癌97例、CIN31例和正常宮頸組織20例中Foxp3、p16INK4a蛋白的表達，并探討其與宮頸癌臨床分期、病理分化類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。探討Foxp3、p16INK4a與血清鱗狀細胞癌相關(guān)抗原水平，

6、HPV感染狀態(tài)的相關(guān)性，以及Foxp3與p16INK4a二者在宮頸癌中的相關(guān)性。
　　2、應(yīng)用Western blot方法檢測宮頸癌細胞中Foxp3的表達;建立Foxp3沉默細胞系;Western blot方法及Real-time PCR檢測基因轉(zhuǎn)染后細胞中Foxp3、p16INK4a蛋白和mRNA的表達;CCK-8法檢測細胞增殖活性;Transwell檢測細胞侵襲能力;細胞周期方法檢測細胞的增殖能力;細胞凋亡實驗檢測Foxp3對

7、細胞凋亡的影響。
　　3、應(yīng)用免疫磁珠分離法(MACS)分離、純化CD8+CTL及CD4+CD25+Treg細胞，建立CD8+CTL細胞特異性殺傷宮頸癌Siha細胞體系。MTT檢測共培養(yǎng)時Siha細胞的活性及ELISA檢測共培養(yǎng)體系上清液的細胞因子（IL-10，TGF-β）。
　　結(jié)果：
　　一、Foxp3、p16INK4a在宮頸癌組織中表達
　　正常宮頸上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的Foxp3、p16

8、INK4a表達逐漸增高，三者間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。宮頸癌組織中Foxp3、p16INK4a表達水平與宮頸癌的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及HPV感染狀態(tài)有關(guān)(P＜0.05）。但是與患者年齡、宮頸癌的分化程度及病理分化類型之間無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、Foxp3對宮頸癌細胞增殖及侵襲能力的影響
　　沉默F(xiàn)oxp3基因的Siha細胞Foxp3、p16INa蛋白、基因的表達明顯低于空白及陰性對照組;CC

9、K-8結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3基因的Siha細胞增殖能力受到抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細胞的穿膜細胞數(shù)明顯低于空白及陰性對照組;細胞周期檢測結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細胞中處于S、G2期的細胞數(shù)目明顯低于空白及陰性對照組;細胞凋亡結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)oxp3的Siha細胞的凋亡細胞數(shù)明顯高于空白及陰性對照組。
　　三、CD4+CD25+Treg細胞對建立CTL細胞特

10、異性殺傷宮頸癌Siha細胞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　采用MACS CD8+positive selection/CD25+positive selection的方法可以獲取CD8+細胞和CD4+CD25+Treg細胞。在體外殺瘤體系中，加入CD4+CD25+Treg細胞，可抑制CD8+CTL細胞對Siha宮頸癌細胞的殺傷作用，通過將D4+CD25+Treg細胞與CD8+CTL分隔培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，分隔培養(yǎng)的CD8+CTL細胞對Siha宮頸癌細胞

11、的殺傷作用明顯強于共同培養(yǎng)的CD8+CTL細胞。共培養(yǎng)體系中上清液中IL-10，TGF-β差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、Foxp3、p16INK4a表達隨著宮頸病變的進展逐漸增高。提示Foxp3、p16INK4a的表達增高可能是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制之一。Foxp3陽性表達率與宮頸癌的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HPV相關(guān)，提示Foxp3表達上調(diào)與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)。
　　2、沉默F(xiàn)oxp3基因能夠顯著抑制宮頸