肝型脂肪酸結(jié)合蛋白對小鼠IgA腎病中腎小球損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的探討.pdf

1、目的：lgA腎病是亞太地區(qū)最常見的原發(fā)性腎小球疾病,是終末期腎衰竭的主要原因。約40％IgA腎病患者在確診后20年內(nèi)進(jìn)入腎功能不全,長期預(yù)后差。目前IgA腎病的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚,缺乏特異性的治療方法。腎內(nèi)氧化應(yīng)激在IgA腎病的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用,多個(gè)研究證實(shí)抗氧化劑治療對IgA腎病有效。
　　 肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)是一種在人類近曲小管上皮細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)(分子量為14.4 kD),可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對脂肪酸的攝

2、取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,并可調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá);它對長鏈脂肪酸的氧化產(chǎn)物具有高度的親和性,是一種重要的細(xì)胞抗氧化因子。近期的研究表明腎小管高表達(dá)的L-FABP抑制了腎小管間質(zhì)的氧化應(yīng)激,發(fā)揮了腎臟保護(hù)作用,但L-FABP在腎小球疾病中的病理生理作用尚未見研究報(bào)道。本研究旨在探討腎小管L-FABP在IgA腎病的發(fā)病過程中所發(fā)揮的病理生理作用及其作用機(jī)制。
　　 本試驗(yàn)從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究:1.腎小管L-FABP在小鼠IgA腎病

3、中的表達(dá)變化;2.L-FABP對小鼠IgA腎病中腎小球損傷的保護(hù)作用;3.系膜細(xì)胞源性TNF-α上調(diào)IgA腎病腎小管L-FABP的表達(dá)及其保護(hù)作用。
　　 材料與方法：
　　 第一部分、IgA腎病發(fā)病ddY鼠作為供體(由日本順天堂大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),11～14周齡人類L-FABP(hL-FABP)轉(zhuǎn)基因(Tg)鼠(n=19)和C57BL/6的野生(WT)鼠(n=19)作為受體行骨髓移植。受體鼠暴露到身體X線照射

4、后,經(jīng)尾靜脈注射途徑移植骨髓干細(xì)胞。WT受體鼠(WT/ddY組)和Tg受體鼠(Tg/ddY組)均在移植后第6周(n=6)和12周(n=10)留取血尿標(biāo)本后分批處死。正常Tg和WT鼠作為對照組。小鼠血清IgA和尿hL-FABP的濃度測定均采用ELISA法。經(jīng)代謝籠收集24h尿液。尿hL-FABP水平以尿L-FABP(ng)/尿肌酐(mg)的比值表示。本部分主要用免疫熒光(IF)染色的方法觀察腎小球系膜區(qū)IgA的沉積,免疫組化,Wester

5、n印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法觀察骨髓移植對hL-FABP腎臟表達(dá)的影響。
　　 第二部分、IgA腎病發(fā)病ddY鼠作為供體(由日本順天堂大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),11～14周齡Tg鼠(n=19)和C57BL/6的WT鼠(n=19)作為受體行骨髓移植。受體鼠暴露到身體X線照射后,經(jīng)尾靜脈注射途徑移植骨髓干細(xì)胞。兩組受體鼠(WT/ddY組和Tg/ddY組)均在移植后第6周(n=6)和12周(n=10)留取血尿標(biāo)本后分批處死。正常T

6、g(n=3)和WT(n=3)鼠作為對照組。小鼠在處死前留尿測24h尿蛋白定量,處死時(shí)留取血和腎組織標(biāo)本。腎組織切片做PAS染色進(jìn)行腎臟病理組織改變的評分,ELISA法測尿蛋白定量,并用Western印跡法檢測腎小球蛋白Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ),纖維連接蛋白(FN)及腎臟4-HNE和HO-1的表達(dá),免疫組化法檢測腎小球浸潤的CD68+細(xì)胞數(shù)目;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腎臟MCP-1的mRNA表達(dá)。
　　 第三部分、原代培養(yǎng)C57B

7、L/6小鼠的系膜細(xì)胞。細(xì)胞在含20％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和5μg/ml胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-鈉亞硒酸鹽培養(yǎng)液補(bǔ)充物的RPMI1640培養(yǎng)液中于37℃、5％CO2孵育箱中孵育。0.25％胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。mProx和mProx-L均在含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液中于37℃、5％CO2孵育箱中孵育。小鼠IgA在63℃加熱150分鐘得到多聚IgA(AIgA)。生長停止的MCs(1×106)與不同濃度的AIg

8、A(AIgA終濃度為10～250μg/ml)共同孵育48h。孵育后收集上清作為.AIgA-MC條件介質(zhì)保存在-80℃。沒有添加AIgA的RPMI1640培養(yǎng)液孵育MC得到的上清作為空白對照。所有的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞長到亞融合狀態(tài)時(shí)加入含有0.5％FCS培養(yǎng)液在實(shí)驗(yàn)開始前同步化16h。進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn):(1)mProx和mProx-L細(xì)胞(1×106)與10倍稀釋的AIgA-MC條件介質(zhì)在DMEM培養(yǎng)液中孵育12h或24h。(2)與中和性抗TNF-

9、α抗體(0.1～5μg/ml)預(yù)孵育1h后再加入AIgA-MC介質(zhì)共同孵育24h。(3)與重組的鼠TNF-α(2～250ng/ml)孵育24h。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞的hL-FABP和MCP-1的mRNA表達(dá),用Western印跡法檢測細(xì)胞的hL-FABP和4-HNE的蛋白表達(dá)。
　　 數(shù)據(jù)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間差異顯著性比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、(1)骨髓移植后Tg/ddY組和WT/ddY組均出現(xiàn)了系膜區(qū)IgA的沉積,第12周IgA的系膜沉積明顯增多,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)兩組小鼠血清IgA水平在骨髓移植后均明顯升高,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)hL-FABP腎臟表達(dá):免疫組化顯示在正常Tg鼠腎臟,hL-FABP彌散地表達(dá)在近曲小管上皮細(xì)胞的胞漿中。Tg/ddY組hL-FABP的陽性染色主要分布于近曲小管上皮細(xì)胞的胞

11、漿和細(xì)胞核。與正常對照組相比,Tg/ddY組腎臟hL-FABP的mRNA(P＜0.001)和hL-FABP的蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)均在第6周顯著升高。尿中hL-FABP水平在第6周時(shí)也顯著升高(59.87±26.75比31.01±14.86μg/g肌酐,P＜0.05)。
　　 第二部分、(1)骨髓移植后第6周,Tg/ddY組的尿白蛋白水平明顯低于WT/ddY組(P＜0.05)。第12周WT/ddY組尿白蛋白水平急劇升高,達(dá)

12、到82.8±65.6mg/dL,而Tg/ddY組的尿白蛋白水平仍然保持一個(gè)較低的水平(8.2±2.2 mg/dL,P＜0.005)。骨髓移植后第12周與Tg/ddY組相比,WT/ddY組腎小球FN(P＜0.05)和ColⅣ(P＜0.0005)蛋白的沉積顯著增加;腎小球浸潤的CD68+細(xì)胞數(shù)目顯著增多(P＜0.05);并出現(xiàn)了更高腎小球病理學(xué)評分(P＜0.0005)和更顯著的系膜基質(zhì)擴(kuò)張(P＜0.01)。(2)應(yīng)用Western印跡法在正

13、常對照組及第12周WT/ddY和Tg/ddY組的腎臟中均未發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)。但第6周,兩組受體鼠的腎臟均出現(xiàn)了HO-1表達(dá),Tg/ddY組HO-1的表達(dá)水平顯著低于WT/ddY組(P＜0.05)。正常對照組和第6周WT/ddY和Tg/ddY腎臟中均未檢測到4-HNE修飾蛋白的表達(dá)。WT/ddY和Tg/ddY組的腎臟4-HNE修飾蛋白的聚集均出現(xiàn)在第12周,Tg/ddV組腎臟4-HNE的聚集水平顯著低于WT/ddY組(P＜0.05)。W

14、T/ddY組腎臟MCP-1mRNA的表達(dá)水平在第12周顯著上調(diào)(P＜0.005),顯著高于Tg/ddY組(P＜0.01)。
　　 第三部分、(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示:不同濃度的AIgA-MC條件介質(zhì)與空白對照相比,可以誘導(dǎo)hL-FABP mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.005);而相同濃度的AIgA單獨(dú)刺激后,hL-FABP mRNA表達(dá)水平的沒有明顯變化。Western印跡顯示:不同濃度的AIgA-MC條件介質(zhì)刺激mProx

15、-L細(xì)胞后,與對照空白相比,均可以誘導(dǎo)hL-FABP蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.00),而AIgA直接刺激后,hL-FABP的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。(2)中和性抗TNF-α抗體與mProx-L預(yù)孵育1h后,加入AIgA-MC條件介質(zhì)共同孵育24h。Western印跡顯示:AIgA-MC介質(zhì)刺激后,hL-FABP的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01);中和性抗TNF-α抗體(終濃度1μg/ml和5μg/ml時(shí))顯著地抑制了hL-FABP蛋

16、白表達(dá)的上調(diào)(分別為P＜0.05和P＜0.01)。(3)Western印跡顯示重組小鼠TNF-α可以顯著上調(diào)mProx-L細(xì)胞hL-FABP的蛋白表達(dá)水平(P＜0.005)。(4)AIgA-MC條件介質(zhì)分別刺激mProx-L和mProx細(xì)胞后,mProx細(xì)胞的4-HNE修飾蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P＜0.05),而mProx-L細(xì)胞刺激前后4-HNE修飾蛋白表達(dá)水平無顯著變化;但刺激后mProx-L細(xì)胞的4-HNE修飾蛋白表達(dá)水平顯著低于

17、mProx細(xì)胞(P＜0.05)。刺激后,兩種細(xì)胞的MCP-1mRNA表達(dá)水平與刺激前比較均明顯上調(diào)(P＜0.001):但mProx-L細(xì)胞的MCP-1mRNA表達(dá)水平顯著低于mProx細(xì)胞(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究結(jié)果表明:
　　 1、骨髓移植后的第6周和第12周,WT/ddY組和Tg/ddY組小鼠的腎小球系膜區(qū)均出現(xiàn)IgA沉積,血清IgA水平較移植前顯著升高,Tg/ddY組小鼠hL-FAB

18、P的mRNA水平和蛋白水平顯著升高,證明本IgA腎病模型造模成功,且L-FABP在本IgA腎病模型中的表達(dá)上調(diào)。
　　 2、骨髓移植后,Tg/ddY組小鼠的腎臟4-HNE,HO-1和MCP-1水平顯著低于WT/ddY組小鼠;而且其腎小球損傷病理評分,腎小球CD68+細(xì)胞的浸潤數(shù)目,腎小球FN和ColⅣ蛋白的沉積水平及尿蛋白水平均顯著低于WT/ddY組小鼠。說明L-FABP可以顯著抑制腎臟的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減輕腎小球損傷,在I

19、gA腎病的早期發(fā)揮腎臟保護(hù)性作用。
　　 3、體外實(shí)驗(yàn)證明:IgA-MC介質(zhì)可顯著上調(diào)hL-FABP的表達(dá),而AlgA直接刺激不能上調(diào)其表達(dá)。中和性抗TNF-α抗體的預(yù)孵育可以顯著抑制這種上調(diào)效應(yīng),且重組鼠的TNF-α可以呈劑量依賴性上調(diào)hL-FABP的表達(dá)。上調(diào)后的L-FABP可以抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。證明IgA腎病系膜細(xì)胞源性TNF-α可以誘導(dǎo)腎小管L-FABP表達(dá)的上調(diào),進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),發(fā)揮腎臟保護(hù)作用