脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白在大鼠肝纖維化組織的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理階段，過度和異常細(xì)胞外基質(zhì)沉積是其組織學(xué)特征，表現(xiàn)為肝竇毛細(xì)血管化、肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)纖維組織增生。與肝硬化不同，肝纖維化階段可逆轉(zhuǎn)，因此肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究是目前肝病研究的熱點(diǎn)之一。
　　脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP,FABP4)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族9個(gè)成員中最具特征的一員，F(xiàn)ABP4不僅在脂肪細(xì)

2、胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，還表達(dá)于全身多種臟器微血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中FABP4的缺失可降低炎癥性轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)和多種促炎反應(yīng)。這種炎癥-代謝反應(yīng)促進(jìn)脂肪炎癥和胰島素抵抗，同時(shí)也促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)生。
　　我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常大鼠和人的多種組織的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)FABP4，但肝臟枯否氏細(xì)胞，小血管和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均未見其表達(dá)。人乙肝纖維化和肝硬化組織部分小血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)FABP4，肝纖維化程度

3、增加其表達(dá)增加。這種表達(dá)形式提示FABP4在肝損傷過程中發(fā)揮作用。
　　四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型是經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷后的肝纖維化模型，聯(lián)苯雙酯是公認(rèn)治療肝纖維化藥物，常作為評價(jià)肝纖維化藥物療效的陽性對照藥。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化和Western blot法檢測CCl4性肝纖維化和聯(lián)苯雙酯治療后大鼠肝組織中FABP4的表達(dá)和變化，關(guān)注肝組織損傷及修復(fù)過程中FABP4，特別是內(nèi)皮細(xì)

4、胞中的FABP4與纖維化消長的關(guān)系，試圖為揭示或闡明肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供新視角。
　　方法:
　　1、大鼠CCl4肝纖維化模型和聯(lián)苯雙酯干預(yù)模型的建立
　　30只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，正常對照組(Control組)、四氯化碳模型組(CCl4組)及聯(lián)苯雙酯干預(yù)組（干預(yù)組），每組10只，雌雄各半。CCl4組和干預(yù)組大鼠皮下給予40％四氯化碳花生油溶液（首次劑量0.5ml/100g，以后0.3ml/100g)

5、; Control組皮下給予等量花生油溶液。同時(shí)干預(yù)組給予2 mg/kg的聯(lián)苯雙酯灌胃，其他兩組大鼠羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)6周。三組停止給予CCl4或花生油后繼續(xù)灌胃2周。CCl4組和干預(yù)組在給予CCl4次日飲用乙醇水、Control組飲用常規(guī)凈化水各8周。
　　2、血天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)

6、測定：腹主動(dòng)脈取血并常規(guī)分離血清，血清于-80℃保存用于血AST、ALT的測定。
　　3、肝臟形態(tài)學(xué)觀察：
　　放血處死動(dòng)物，觀察肝臟、脾臟，稱重，計(jì)算肝臟、脾臟系數(shù)。肝組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。觀察肝臟組織學(xué)改變。
　　4、免疫組織化學(xué)檢測FABP4、ED1和α-SMA的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)檢測石蠟切片中FABP4(PV二步法)，ED1和α-SMA(α-smooth muscle actin)(SP三

7、步法)在各組肝組織的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)（一抗非共孵育法）檢測FABP4和ED1共表達(dá)。
　　5、FABP4、ED1和α-SMA表達(dá)的定量分析
　　采用OLYMPUS BX63顯微成像系統(tǒng)，每張切片照相后使用Image-ProPlus6.0軟件對圖片進(jìn)行FABP4定量分析。ED1和α-SMA采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法:每張切片計(jì)數(shù)高倍鏡下(400倍)10個(gè)視野肝小葉內(nèi)有核陽性細(xì)胞數(shù)。
　　6、Western blot法進(jìn)行FAB

8、P4和α-SMA半定量分析
　　結(jié)果:
　　1、成功建立大鼠CCl4肝纖維化模型和聯(lián)苯雙酯干預(yù)組模型
　　(1)肝臟形態(tài)學(xué)改變:與Control組比較，CCl4組肝臟色黃，質(zhì)地變硬，表面粗糙呈顆粒狀。干預(yù)組大鼠肝臟色粉紅，表面沒有明顯顆粒狀物質(zhì)，質(zhì)地較CCl4組軟。CCl4組肝臟系數(shù)(3.74±0.73)較Control組(2.54±0.26)高(P＜0.01);干預(yù)組肝臟系數(shù)(3.00±0.28)較CCl4組明顯下降

9、(P＜0.05），但仍高于Control組(P＜0.05）。脾臟系數(shù)三組間未見差異。
　　(2)組織學(xué)改變:CCl4組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞水樣和脂肪變性、灶狀壞死及炎細(xì)胞浸潤，增生的纖維組織從匯管區(qū)呈星芒狀伸向肝小葉。干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細(xì)胞的變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤較CCl4組明顯減輕，匯管區(qū)可見少量纖維增生。
　　(3)血清AST、ALT∶ CCl4組血清AST和ALT水平較Control組顯著升高[AST:

10、394±160(CCl4組)，189±99(Control組)，P＜0.05;ALT:335±252(CCl4組)，73±55(Control組)，P＜0.01]。干預(yù)組AST和ALT較CCl4組顯著下降(干預(yù)組AST:183±71，P＜0.01;ALT:66±31,P＜0.05)，與Control組相比無顯著差異。
　　2、大鼠肝組織FABP4的表達(dá)變化
　　免疫組化結(jié)果，Control組肝組織幾乎未見FABP4的表達(dá);C

11、Cl4組肝小葉內(nèi)壞死區(qū)和纖維間隔內(nèi)可見單個(gè)散在分布的FABP4陽性細(xì)胞，部分小血管和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)FABP4;干預(yù)組FABP4的表達(dá)方式與CCl4組相似。FABP4(綠色)和ED1（紅色）的免疫熒光雙標(biāo)顯示:單個(gè)散在分布的FABP4陽性細(xì)胞為枯否氏細(xì)胞（黃色熒光）。定量分析結(jié)果:CCl4組肝組織FABP4積分光密度(Integra optical density, IOD)(70367.99，81339.00)比Control組(28

12、5.63，302.00)有意義升高(P＜0.05);干預(yù)組IOD值(6123.50，8609.00)則明顯低于CCl4組(P＜0.05），但仍高于Control組(P＜0.05)。WesternBlot分析證實(shí)CCl4組肝組織FABP4的表達(dá)明顯高于Control組;聯(lián)苯雙酯干預(yù)后FABP4的表達(dá)量有意義下降，但仍高于Control組(P均＜0.05）。
　　3、大鼠肝臟組織ED1和α-SMA的表達(dá)變化
　　Control組

13、ED1陽性細(xì)胞位于肝竇和匯管區(qū)。CCl4組肝竇、匯管區(qū)陽性細(xì)胞增多、壞死區(qū)可見陽性細(xì)胞。干預(yù)組表達(dá)形式與CCl4組基本相同。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:CCl4組陽性細(xì)胞數(shù)(47.00，27.00)明顯高于Control組(7.00，7.00)(P＜0.05）;聯(lián)苯雙酯干預(yù)(23.00，14.00)可明顯降低CCl4引起的ED1陽性細(xì)胞數(shù)(P＜0.05），但仍高于Control組(P＜0.05）。CCl4組的α-SMA表達(dá)于肝竇、纖維間隔、壞死灶及小

14、血管平滑肌。干預(yù)組α-SMA表達(dá)形式與CCl4組基本相同。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:與Control組(0.00，0.00)相比，CCl4組α-SMA陽性細(xì)胞有意義增多(25.50，49.00)(P＜0.05);聯(lián)苯雙酯干預(yù)(1.00，3.00)能明顯降低CCl4引起的α-SMA陽性表達(dá)(P＜0.05)，但仍高于Control組(P＜0.05）。Western Blot分析證實(shí)，CCl4組肝組織α-SMA的表達(dá)明顯高于Control組，與CCl4組

15、相比，聯(lián)苯雙酯干預(yù)后α-SMA的表達(dá)量有意義下降，但仍高于Control組（P均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、與正常肝組織比較，肝纖維化組織中FABP4呈現(xiàn)出陽性表達(dá);陽性表達(dá)的細(xì)胞為枯否氏細(xì)胞和小血管內(nèi)皮細(xì)胞。這種與生理狀態(tài)下完全不同的表達(dá)方式和表達(dá)量的變化提示FABP4作為功能蛋白在肝炎癥性損傷和修復(fù)過程中扮演了重要角色。
　　2、聯(lián)苯雙酯干預(yù)明顯降低CCl4誘發(fā)的FABP4表達(dá)和ED1陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)α-S