FXR對肝型脂肪酸結合蛋白表達的影響及其機制的初步研究.pdf

1、研究背景:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)是一種非過量飲酒所致的,以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征,其中肝脂肪酸代謝異常與NAFL發(fā)生發(fā)展密切相關,L-FABP是脂肪結合蛋白超家族的一員,在肝臟和小腸中高表達,調節(jié)著脂肪酸的攝取、轉運、氧化以及酯化,近年來研究發(fā)現(xiàn),L-FABP缺陷型小鼠能有效抵抗高脂飲食所誘導的脂肪肝,因而研究L-FABP對防治脂肪肝有重要意義。法尼酯X受體

2、(farnesoid X receptor,FXR)是核受體超家族成員,通過調節(jié)諸多靶基因而在調控膽汁酸、脂類和葡萄糖的代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用,FXR的功能喪失與非酒精性脂肪肝密切相關。FXR和L-FABP主要在肝臟中表達,兩者均與NAFL中有密切關系,那么研究FXR是否調控L-FABP的表達,將為進一步闡明二者在NAFL發(fā)生發(fā)展中的作用及為尋找防治NAFL的新靶點提供新的科學依據(jù)。
　　 研究目的:探討FXR對L-FA

3、BP表達的影響及其調節(jié)的可能機制。
　　 研究方法:1.選取人胎肝細胞株L02和人肝癌細胞株HepG2為細胞模型,經(jīng)FXR特異性激動劑CDCA或GW4064處理后,用逆轉錄.聚合酶鏈反應(RT-PCR)法和Western blotting免疫印跡法分別檢測L-FABP在mRNA和蛋白水平的差異變化。2.用不同濃度的FXR激動劑CDCA(0mg/kg、10mg/kg、50mg/kg)灌胃C57BL/6小鼠7天后,取小鼠肝組織,采用

4、半定量RT-PCR檢測L-FABPmRNA表達水平,免疫組化和Western blotting免疫印跡法檢測L-FABP蛋白表達變化。3.在線預測人L-FABP基因5'側翼啟動子區(qū)域存在FXR可能結合位點,DR9分值最高,為FXR的結合位點的可能性最大;提取HepG2細胞基因組DNA,PCR擴增包含DR-9的L-FABP基因啟動子區(qū),構建熒光素酶報告基因重組質粒pGL-2984/+128,以及構建不含DR9位點的pGL-2172/+11

5、,利用脂質體,將其與FXR的表達質粒Vp-FXR共轉染到HepG2細胞中,24小時后檢測各組報告基因表達活性。
　　 研究結果:1.經(jīng)FXR特異性激動劑GW4064或CDCA處理后,L02和HepG2細胞內的L-FABPmRNA和蛋白水平顯著下降(p＜0.05)。2.動物在喂食含CDCA食物7天后,經(jīng)RT-PCR測得L-FABPmRNA水平有明顯下調;免疫組化結果顯示:隨著CDCA濃度的增加;L-FABP在肝臟組織的表達呈下降水

6、平;Western blotting免疫印跡法結果表明:L-FABP蛋白表達與對照組相比也顯著降低。3.在HepG2細胞中,共轉染Vp-FXR可降低含DR9位點的pGL-2984/+128活性,但對不含DR9位點的pGL-2172/+11的活性無影響。
　　 研究結論:實驗證實FXR激活后在體內外均可下調L-FABP的表達。因此,我們可以推測L-FABP是FXR作用于肝臟的新的靶基因。通過報告基因分析,FXR調控L-FABP的表