不同脂肪酸對中華絨螯蟹脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3,FABP9,FABP10的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又稱河蟹，屬甲殼綱，十足目，方蟹科，絨螯蟹屬，目前已經(jīng)成為我國重要養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)蟹類。脂類在魚類、蝦蟹類等水產(chǎn)動物的生長、生理活動中發(fā)揮十分重要的作用，而肝胰腺是中華絨螯蟹脂類代謝中心，脂類含量對其結(jié)構(gòu)、功能和生化組成具有重要影響。脂肪酸結(jié)合蛋白FABP的種類和分布與其結(jié)合的脂肪酸、組織的脂肪酸需求及其參與的功能有著密切關(guān)系。研究表明甲殼動物FABP的種類分化較少但參與多種生理過程，而目前對

2、其配基及親和力及功能的研究甚少。本研究在已有的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，采用RT-PCR技術(shù)從中華絨螯蟹肝胰腺組織中克隆了FABP3、FABP9和FABP10基因，通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)過表達(dá)和純化獲得Es-FABP3、9和10三種可溶性目的蛋白并以此蛋白作為材料，利用穩(wěn)態(tài)熒光光譜對中華絨螯蟹FABP與脂肪酸等疏水配基的親和力進(jìn)行分析，并在離體條件下通過熒光定量PCR研究單一脂肪酸對Es-FABP3、9和10的調(diào)控作用。通過以上研

3、究闡明中華絨螯蟹FABP與脂肪酸的親和力，脂肪酸代謝相關(guān)基因FABP3、FABP9和FABP10在不同脂肪酸調(diào)控下的相互作用關(guān)系，同時為甲殼動物FABP分化與功能研究的深入提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果和結(jié)論具體如下：
　　1、FABP3、FABP9、FABP10原核表達(dá)及蛋白純化
　　通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查詢3中脂肪酸結(jié)合蛋白核苷酸序列，根據(jù)FABP3、FABP9和FABP10的核苷酸序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，在上下游分

4、別插入酶切位點(diǎn)Bam HI和Nde I。從中華絨螯蟹肝胰腺組織中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)得到cDNA，以此為模板進(jìn)行TA克隆得到帶有酶切位點(diǎn)的FABP3、FABP9和FABP10基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并純化，電泳分析其條帶約為400bp，與預(yù)期結(jié)果相符。將獲得的目的基因與pMD-19T載體連接，PCR鑒定并測序，將測序正確的質(zhì)粒酶切后回收目的片段。將目的基因正向插入pET-15b中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-15b-FABP3、p

5、ET-15b-FABP9和pET-15b-FABP10，將這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了目的蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均在15KD左右，與預(yù)期結(jié)果相符。利用融合蛋白中帶有的His標(biāo)簽，經(jīng)過鎳離子柱親和層析純化表達(dá)的FABP3、FABP9和FABP10，以此為材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、FABP3、FABP9、FABP10與不同脂肪酸親和力分析

6、　　獲得中華絨螯蟹脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3、FABP9和FABP10重組可溶性蛋白后，采用穩(wěn)態(tài)熒光技術(shù)研究不同脂肪酸與中華絨螯蟹FABP3、FABP9和FABP10的結(jié)合特性。利用ANS作為熒光標(biāo)記，通過穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜研究脂肪酸與三種FABP的結(jié)合，通過解離常數(shù)的計(jì)算最終計(jì)算得到FABP3、FABP9和FABP10與不同脂肪酸親和力大小。結(jié)果顯示FABP3與長鏈脂肪酸有較高親和力，F(xiàn)ABP9與不同脂肪酸的親和力大小隨著碳鏈的延長，親和

7、力逐漸變小，F(xiàn)ABP10則與短鏈脂肪酸有較高的親和力。因此我們推測FABP3、FABP9和FABP10與不同脂肪酸親和力不同與FABP的功能以及內(nèi)腔結(jié)構(gòu)的不同相關(guān)。
　　3、不同脂肪酸作用肝胰腺其FABP3、FABP9和FABP10表達(dá)變化
　　本論文采用離體培養(yǎng)技術(shù)，旨在研究不同脂肪酸水平對中華絨螯蟹肝胰腺中脂肪酸結(jié)合蛋白FABP3，F(xiàn)ABP9和FABP10表達(dá)量的影響。取中華絨螯蟹肝胰腺組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中分

8、別加入50μm/L，100μm/L和250μm/L三種濃度的棕櫚酸(PA)，油酸(OA)，亞油酸(LA)，花生四烯酸(ARA)，DHA和EPA六種脂肪酸。分別在離體培養(yǎng)24小時后，運(yùn)用 Real-Time PCR技術(shù)，研究組織內(nèi)FABP3、FABP9和 FABP10在不同種脂肪酸作用下的表達(dá)變化。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入50μm/L，100μm/L，250μm/L DHA、EPA和亞油酸，體外培養(yǎng)24h后，都促進(jìn)了FABP9基因的表達(dá)。

9、其中DHA組在100μm/L時FABP9基因的表達(dá)量最高；而FABP3和FABP10的表達(dá)量在加入三種濃度DHA條件并未受到顯著影響。亞油酸組則在250μm/L時FABP9的表達(dá)量最高；而FABP3和FABP10基因表達(dá)量在加入三種濃度DHA條件并未受到顯著影響。在培養(yǎng)基中添加三種濃度的花生四烯酸，油酸和棕櫚酸體外培養(yǎng)24 h后，F(xiàn)ABP3、FABP9和FABP10的表達(dá)量都沒有顯著性差異。FABP3、FABP9和 FABP10的表達(dá)水