多重PCR檢測水產(chǎn)品中四種食源性致病菌的研究與檢測試劑盒的開發(fā).pdf

1、我國足水產(chǎn)品的生產(chǎn)和消費大國,已成為世界水產(chǎn)品行業(yè)的支柱,而水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、捕撈、儲藏、加工、運輸、銷售等環(huán)節(jié)容易受到病原微生物的污染,因此病原微生物檢測是水產(chǎn)品及其加工品衛(wèi)生檢測中的一項重要工作,其關(guān)系到消費者的健康及生命安全。其中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌被認為是重要的污染水產(chǎn)品的致病菌,已引起各個國家衛(wèi)生檢測部門及疾病控制中心的廣泛重視。我國標準DB11/519-2008《生食水產(chǎn)品衛(wèi)生要求》規(guī)定致病菌不

2、得檢出。然而傳統(tǒng)致病菌檢測方法存在檢測時間長,一般檢測周期在5-10天,檢測程序繁瑣,工作量大等缺點,因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測方法,以滿足現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要。
　　 本研究旨在利用多重PCR技術(shù)系統(tǒng)地建立水產(chǎn)品及其加工制品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌四種常見食源性致病菌的快速檢測方法,對此方法進行優(yōu)化和評價,并基于此方法開發(fā)出可用于實際水產(chǎn)品及其加工制品

3、的目標致病菌檢測的SSSVm-PCR檢測試劑盒,具體實驗內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.設(shè)計制備一種能夠同時富集沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的復(fù)合共增菌培養(yǎng)基SSSV,用于水產(chǎn)品中上述常見四種食源性致病菌的同時快速增菌。以緩沖蛋白胨水為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過挑選適合的促進劑、抑制劑及營養(yǎng)物質(zhì)進行單岡素試驗和正交試驗,確定其最佳成分及配比;分析了SSSV培養(yǎng)基對目標菌的生長選擇性及生長特性,并通過Gompertz方程構(gòu)建

4、生長模型,獲得四種目標菌在SSSV中的對數(shù)生長率(EGR)、傳代時間(GT)、停滯期(LPD)及最大菌落密度(MPD)四個生長特性參數(shù);通過人工污染試驗,分析了SSSV對不同貯藏條件下的水產(chǎn)品中目標致病菌的修復(fù)能力,最后比較了SSSV與營養(yǎng)肉湯及國標中各自選擇性增菌液對實際水產(chǎn)樣品的檢測效果。結(jié)果表明,獲得的共增菌培養(yǎng)基SSSV對非目標菌表現(xiàn)出一定的抑制性,能同時富集不同接種比例組成的混合菌,37℃培養(yǎng)8 h后,菌體濃度均可達到104-

5、107 CFU/mL;SSSV能有效修復(fù)冷藏和凍藏水產(chǎn)品中冷受傷的目標致病菌,人工污染102CFU/mL目標菌的冷藏和冷凍蝦仁、目魚卷及魚丸樣品經(jīng)SSSV培養(yǎng)基在37℃分別培養(yǎng)8 h和12h可使菌體濃度達到105-106 CFU/mL;SSSV對實際水產(chǎn)樣品中四種致病菌的增菌效果優(yōu)于營養(yǎng)肉湯,但略差于國標中目標菌各自選擇性增蔭液。V2、篩選出金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐熱核酸酶基因nuc、沙門氏菌(S

6、almonella spp.)的侵襲蛋白基因invA、志賀氏菌(Shigella spp.)的侵染性質(zhì)?？乖璈基因ipaH和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的毒力表達調(diào)控基因toxR作為目標靶基因并設(shè)計相應(yīng)引物對,建立并優(yōu)化了一種快速檢測水產(chǎn)品中上述四種常見食源性致病菌的多重:PCR方法。結(jié)果顯示,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR擴增片段產(chǎn)物大小分別為549 bp、426 bp、3

7、48 bp、243 bp,通過序列測序及BLAST比對證明了擴增產(chǎn)物的準確性;該檢測方法具有良好的特異性和靈敏度,四種目標菌的檢測限分別為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌102CFU/mL,沙門氏菌和副溶血性弧菌為101 CFU/mL。SSSV富集培養(yǎng)與該多重PCR方法聯(lián)用,對50份實際水產(chǎn)樣品進行檢測,并與國標方法對比驗證得出,四種致病菌的整體檢測符合率達97％以上,兩種檢測方法無顯著性差異(P＞0.05),但檢測時間大幅縮短,可在24 h內(nèi)

8、完成樣品的檢驗。
　　 3、實現(xiàn)了對上述多重PCR檢測方法的產(chǎn)品化組裝,開發(fā)成適合快速檢測水產(chǎn)品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的檢測試劑盒SSSV m-PCR Kit。對該試劑盒的保存方式,穩(wěn)定性及重復(fù)性進行了測定和評價。結(jié)果表明,該實際盒檢測效果穩(wěn)定,可重復(fù)性好,4℃保存條件下最長可30 d-60 d,在-20℃或-80℃條件保存,其保質(zhì)期可接近或達到一年,但試劑的反復(fù)凍融對試劑盒的檢測效果影響較大,使用者