內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理對(duì)低密度脂蛋白介導(dǎo)的腎臟局部炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　脂質(zhì)介導(dǎo)的腎臟損傷是導(dǎo)致慢性腎臟疾病(CKD)的重要原因之一，在這一過程中，脂質(zhì)和炎癥扮演了同樣重要的角色。大量研究已證實(shí)，炎癥在脂質(zhì)腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用；抑制腎臟的炎癥反應(yīng)對(duì)脂質(zhì)腎損傷有顯著的改善作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白（LDL）及其氧化產(chǎn)物-氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）本身就具有促炎介質(zhì)的特性，其通過介導(dǎo)腎臟局部的炎癥反應(yīng)，增加膽固醇在腎臟固有細(xì)胞內(nèi)的聚集，形成腎臟脂質(zhì)聚集的“惡性循環(huán)”。

2、深入探討脂質(zhì)介導(dǎo)的腎臟局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制和干預(yù)措施，可為進(jìn)一步了解脂質(zhì)腎損傷的作用機(jī)理及尋求新的治療方向奠定基礎(chǔ)。
　　衣霉素（TM）是一種誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激動(dòng)劑，它能刺激體細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；但脂質(zhì)腎損傷的病理過程中是否具有相同的作用及其具體的作用機(jī)制目前尚不清楚。
　　在本研究中，我們擬通過細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，觀察LDL對(duì)腎臟局部炎

3、癥反應(yīng)的作用，探討LDL介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在該炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中的作用以及干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)該信號(hào)通路的影響。
　　方法
　　1．選取人系膜細(xì)胞（HMCs）為研究對(duì)象，200nmol/L的LDL作為干預(yù)措施，0.1ug/ml的TM預(yù)先刺激系膜細(xì)胞8小時(shí)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理措施，以lipofectamin2000為載體分別將XBP1-siRNA和IRE1α-siRNA轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞24小時(shí)作為基因沉默措施，

4、XBP1s-GFP轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞72小時(shí)作為基因過表達(dá)措施。將細(xì)胞分為：對(duì)照組、TM組、LDL組、TM+LDL組、IRE1α-siRNA+LDL組、XBP1-siRNA+TM+LDL組和XBP1s-GFP+LDL組，在1、6、24小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2．Real time PCR檢測(cè)IL-6、TNF-α、CD40、MCP-1的mRNA。
　　3．Western blot檢測(cè)磷酸化的IRE1α、IKK和NF-κB P6

5、5蛋白。
　　4．免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NF-κB P65的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果
　　1．與對(duì)照組比較，LDL作用HMCs后1h、6h和24h時(shí)間點(diǎn)IL-6、MCP-1、TNF-α和 CD40mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；磷酸化的IRE1α、IKK和NF-κB p65蛋白水平顯著增加；NF-κB p65核轉(zhuǎn)位顯著增多。
　　2．使用IRE1α-siRNA轉(zhuǎn)染HMCs，在給予和未給予IRE1α-siRNA轉(zhuǎn)染的HM

6、Cs中分別加入LDL；與未轉(zhuǎn)染組比較，IRE1α-siRNA轉(zhuǎn)染組1h、6h和24h時(shí)間點(diǎn)IL-6、 MCP-1、TNF-α和CD40mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；磷酸化的IKK和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下降。
　　3．使用0.1ug/ml的TM作用HMCs8h；與對(duì)照組比較，TM作用HMCs后 IL-6、 MCP-1、TNF-α和 CD40mRNA表達(dá)無顯著差異(P>0.05)； XBP1蛋白水平顯著增加。

7、　　4．在給予和未給予TM預(yù)處理的HMCs中分別加入LDL；與未給予TM預(yù)處理組比較，TM預(yù)處理組1h、6h和24h時(shí)間點(diǎn)IL-6、MCP-1、TNF-α和CD40mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；磷酸化的IRE1α、IKK和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下降；NF-κB p65核轉(zhuǎn)位顯著減少。
　　5．使用XBP1-siRNA轉(zhuǎn)染HMCs；在給予和未給予XBP1-siRNA轉(zhuǎn)染的HMCs中分別加入TM(0.1ug/ml)預(yù)作

8、用8小時(shí)后，再加入LDL（200nmol/L）作用；與未轉(zhuǎn)染組比較，XBP1-siRNA轉(zhuǎn)染組1h、6h和24h時(shí)間點(diǎn)IL-6、MCP-1、TNF-α和CD40mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，磷酸化的IRE1α、IKK和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著增加，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位顯著增多。
　　6．在給予和未給予XBP1s-GFP轉(zhuǎn)染的HMCs中分別加入LDL；與未轉(zhuǎn)染組比較，XBP1s-GFP轉(zhuǎn)染組1h、6h和24h時(shí)間點(diǎn)

9、 IL-6、MCP-1、TNF-α和 CD40mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；磷酸化的IRE1α、IKK和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著下降；NF-κB p65核轉(zhuǎn)位顯著減少。
　　結(jié)論
　　1．LDL作用于HMCs導(dǎo)致了顯著的炎癥反應(yīng)，IRE1α/IKK/NF-κB通路是LDL介導(dǎo)的HMCs炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路之一。
　　2．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理可以通過上調(diào)XBP1，抑制IRE1α/ IKK/NF-κB信號(hào)通路,從而