PERK-eIF2α通路介導(dǎo)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及辛伐他汀的干預(yù)作用.pdf

1、第一章PERK/eIF2α通路介導(dǎo)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究
　　目的:探討PERK/eIF2α通路在氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　(1)研究ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白磷酸化的影響。
　　培養(yǎng)細(xì)胞分為8組:其中4組是在培養(yǎng)液中不加入任何干預(yù)因素，內(nèi)皮細(xì)胞分別培養(yǎng)0，12，24，48小時;另有組在培養(yǎng)液中加入ox-LDL(1

2、0.0μg/ml)，內(nèi)皮細(xì)胞分別培養(yǎng)0，12，24，48小時。采用western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白磷酸化。
　　(2)研究PERK基因沉默后對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、caspase-3、CHOP的影響。分為6組:空白對照組:不加任何干預(yù)因素，孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h;非靶點sh RNA組或PERK sh RNA組:分別轉(zhuǎn)染非靶點sh RNA或PERK sh RNA入內(nèi)皮細(xì)胞后，孵育內(nèi)皮細(xì)胞24

3、h; ox-LDL組:ox-LDL(10.0μg/ml)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;Ox-LDL+非靶點sh RNA組或Ox-LDL+PERK sh RNA組:在成功轉(zhuǎn)染非靶點sh RNA或PERK sh RNA入內(nèi)皮細(xì)胞后，用ox-LDL(100μg/ml)繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率檢測采用流式細(xì)胞儀;內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的caspase-3活性測定采用比色法;CHOP mRNA水平采用Real-time PCR法檢測。
　　(3

4、)研究特異性eIF2α磷酸化抑制劑Salubrinal對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、caspase-3、CHOP的影響。分為4組:空白對照組:不加任何干預(yù)因素，孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h; ox-LDL組:ox-LDL(100μg/ml)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+salubrinal或單純salubrinal組:40μM的salubrinal預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1h后，分別用含100μg/ml ox-LDL的DMEM培養(yǎng)液或用含1％小牛血清的DME

5、M培養(yǎng)液繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率檢測采用流式細(xì)胞儀;內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的caspase-3活性測定采用比色法;CHOP mRNA水平采用Real-time PCR法檢測。
　　(4)研究PERK基因沉默后對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eIF2α蛋白磷酸化的影響。分為4組:空白對照組:不加任何干預(yù)因素，孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h; ox-LDL組:ox-LDL(10.0μg/ml)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;Ox-LDL+PERK sh R

6、NA組:在成功轉(zhuǎn)染PERK sh RNA入內(nèi)皮細(xì)胞后，用ox-LDL(100μg/ml)繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+salubrinal組:40μM的salubrinal預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1h后，用含100μg/ml ox-LDL的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時。
　　結(jié)果:
　　(1)ox-LDL呈時間依賴性的增加內(nèi)皮細(xì)胞PERK蛋白表達(dá)及eIF2α的磷酸化。
　　(2)與對照組相比，ox-LDL(100μg/m

7、l)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24小時顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性，升高內(nèi)皮細(xì)胞CHOP mRNA水平，PERK基因沉默或給予特異性eIF2α磷酸化抑制劑Salubrinal后可抑制上述過程。
　　(3)與對照組相比，ox-LDL促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞eIF2α蛋白磷酸化，PERK基因沉默后或加入特異性eIF2α磷酸化抑制劑Salubrinal后，可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eIF2α蛋白的磷酸化。
　　結(jié)論:

8、
　　(1) ox-LDL可觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　(2) ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與激活PERK/eIF2(α)CHOP/caspase-3通路有關(guān)。
　　第二章辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　　目的:探討辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其與PERK/eIF2α通路的關(guān)系。
　　方法:
　　(1)研究辛伐他汀對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮

9、細(xì)胞凋亡、CHOPmRNA、caspase-3活性的影響。
　　培養(yǎng)細(xì)胞分為7組:空白對照組:用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL+辛伐他?。?.1μM）組:加入終濃度為0.1μM的辛伐他汀孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/mlox-LDL繼續(xù)孵育24小時;ox-LDL+辛伐他汀(0.5μM)組:加入終濃度為0.5μM的辛

10、伐他汀孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/mlox-LDL繼續(xù)孵育24小時;ox-LDL+辛伐他?。?.5μM）組:加入終濃度為2.5μM的辛伐他汀孵育細(xì)胞1小時后，加入10.0μg/ml ox-LDL繼續(xù)孵育24小時;+salubrinal組:加入終濃度為40μM的salubrinal（特異性eIF2α磷酸化抑制劑）孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/mlox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;+DEVD-CHO組:加入終濃度為100μ

11、M的DEVD-CHO(特異性caspase-3抑制劑)孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;采用流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，采用Real-time PCR法檢測CHOPmRNA的表達(dá)，采用比色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性。
　　(2)研究辛伐他汀對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白磷酸化的影響。
　　培養(yǎng)細(xì)胞分為6組:空白對照組:用含1％小牛血清

12、的DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL組:用含100μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;ox-LDL+辛伐他汀（0.1μM）組:加入終濃度為0.1μM的辛伐他汀孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/mlox-LDL繼續(xù)孵育24小時;ox-LDL+辛伐他汀（0.5μM）組:加入終濃度為0.5μM的辛伐他汀孵育細(xì)胞1h后，加入100μg/ml ox-LDL繼續(xù)孵育24 h;ox-LDL+辛伐他?。?.5μM）組:加

13、入終濃度為2.5μM的辛伐他汀孵育細(xì)胞1小時后，加入100μg/ml ox-LDL繼續(xù)孵育24小時;+salubrinal組:加入終濃度為40μM的salubrinal（特異性eIF2α磷酸化抑制劑）孵育細(xì)胞1h后，加入10.0μg/ml ox-LDL的培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時;采用western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白的磷酸化。
　　結(jié)果:
　　(1)與對照組相比，ox-LDL(100μg/

14、ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24小時顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，辛伐他?。?.1μM，0.5μM和2.5μM）呈濃度依賴性的抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。特異性eIF2α磷酸化抑制劑Salubrinal（40μM）或特異性的caspase-3阻斷劑DEVD-CHO(100μM)可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3活性，升高內(nèi)皮細(xì)胞CHOP mRNA水平，PERK基因沉默或給予特異性eIF2α磷酸化抑制劑

15、Salubrinal后可抑制上述過程。
　　(2)與對照組相比，ox-LDL(100μg/ml)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24小時顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白磷酸化，辛伐他汀（0.1μM，0.5μM和2.5μM）呈濃度依賴性的抑制ox-LDL誘導(dǎo)的PERK蛋白表達(dá)及eIF2α蛋白磷酸化。特異性eIF2α磷酸化抑制劑Salubrinal(40μM)可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的eIF2α蛋白磷酸化，但對PERK蛋白表達(dá)沒有影響。