內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷及蚯蚓活性組分對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：研究蚯蚓活性組分（EWAs）對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制
　　方法：1.EWAs的提?。阂孕迈r冰凍赤子愛勝蚯蚓（eisenia foetida）為原材料，采用膠體磨勻漿、乙醇沉淀、冷凍干燥和Sephadex G-25層析脫鹽等步驟制備 EWAs，對 EWAs的理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究。2.構(gòu)建衣霉素誘導(dǎo)的 L02細(xì)胞（人正常肝細(xì)胞系）ERS模型：培養(yǎng) L02細(xì)胞，分為空白對照組和衣霉素組，衣霉素組用濃度

2、為20、40、60、80和100μg/ml的衣霉素分別作用12、24和48h，用 MTT法檢測不同濃度衣霉素對 L02細(xì)胞增殖率的影響，計(jì)算 IC50值；用TUNEL法檢測衣霉素作用不同時(shí)間后L02細(xì)胞的凋亡情況；用Western blot檢測衣霉素作用不同時(shí)間后 ERS標(biāo)志性因子 GRP78和 CHOP的表達(dá)水平。3.研究 EWAs對 ERS介導(dǎo)的受損 L02細(xì)胞的保護(hù)作用及分子機(jī)制：在 L02細(xì)胞的 ERS模型（衣霉素60μg/ml

3、作用24h）的基礎(chǔ)上，用不同濃度 EWAs作用24h，用 MTT法檢測 EWAs對衣霉素誘導(dǎo)的受損 L02細(xì)胞增殖率的影響；用TUNEL法檢測高、低劑量 EWAs對受損 L02細(xì)胞凋亡情況的影響；用 Western blot及RT-PCR檢測高、低劑量EWAs作用前后，ERS特異性凋亡因子CHOP及其上游信號通路因子PERK、eIF2a和ATF4蛋白和mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.成功獲取 EWAs，收率為12％，外觀為黃白

4、色絮狀物，極易溶于水，蛋白含量為57.64%，主要是分子量在20KDa以下的小肽。2.成功構(gòu)建衣霉素誘導(dǎo)的 L02細(xì)胞的 ERS損傷模型。最佳誘導(dǎo)條件為60μg/mL衣霉素作用24h。3. MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，0.2、0.4、0.8、1.2和1.6mg/mL的EWAs作用24h后，EWAs可促進(jìn)ERS介導(dǎo)的受損L02細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P<0.05）；4. TUNEL結(jié)果顯示，0.4mg/mL和1.2mg/mL的

5、EWAs作用24h后，模型組中 L02細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯較空白對照組顯著增高（ P<0.01），與模型組相比， EWAs高、低劑量組的凋亡指數(shù)明顯減少（P<0.01）；5.Western blot結(jié)果顯示，模型組中ERS特異性凋亡因子CHOP及其上游信號通路因子 PERK、eIF2a和 ATF4蛋白的表達(dá)明顯高于空白對照組（P<0.01），與模型組相比，EWAs可顯著減少受損 L02細(xì)胞中 ERS特異性凋亡因子 CHOP及其上游信號通路

6、因子 PERK、eIF2a和 ATF4蛋白的表達(dá)（P<0.01）；6. RT-PCR結(jié)果顯示，模型組中 ERS特異性凋亡因子 CHOP及其上游信號通路因子 PERK、eIF2a和 ATF4 mRNA的表達(dá)明顯高于空白對照組（P<0.01），與模型組相比，EWAs可顯著減少受損 L02細(xì)胞中 ERS特異性凋亡因子 CHOP及其上游信號通路因子 PERK、eIF2a和 ATF4 mRNA的表達(dá)（P<0.01）。
　　結(jié)論：1.建立了