內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肺復(fù)蘇后腦損傷的關(guān)系及干預(yù)研究.pdf

1、【目的】最近在許多缺血再灌注損傷的研究中都發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腦損傷的病理生理中起著非常重要的作用，且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可對(duì)腦組織起到一定的保護(hù)作用。本研究將SD大鼠作為研究對(duì)象，建立心臟驟停及心肺復(fù)蘇模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肺復(fù)蘇后腦損傷的相關(guān)性，并使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal進(jìn)行干預(yù)，初步闡明其可能的作用機(jī)制。
　　【方法】：實(shí)驗(yàn)一，對(duì)SD大鼠采用經(jīng)皮電刺激心外膜法制備心臟驟停模型并成功進(jìn)行復(fù)蘇，分別在造模前和復(fù)蘇后1小

2、時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)處死大鼠，取海馬組織進(jìn)行RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)，分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物（GRP78和XBP-1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白(CHOP和caspase12)的表達(dá)趨勢。實(shí)驗(yàn)二，SD大鼠隨機(jī)分為3組：（1）sham組：僅進(jìn)行麻醉、經(jīng)口氣管插管和動(dòng)靜脈置管操作；（2） Sal+CPR組：采用經(jīng)皮電刺激心外膜法制備心臟驟停模型并成功進(jìn)行心肺復(fù)蘇，在造模前30分鐘，腹腔注射Salubrinal(S

3、al,1 mg/kg)，（3）DMSO+CPR組：采用經(jīng)皮電刺激心外膜法制備心臟驟停模型并成功進(jìn)行心肺復(fù)蘇，在造模前30分鐘，腹腔注射等量的DMSO。心肺復(fù)蘇后24小時(shí)觀察各組大鼠生存情況，利用NDS評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)各組大鼠的神經(jīng)功能情況。隨后過量麻醉處死大鼠，取腦組織進(jìn)行后續(xù)研究：①通過透射電鏡觀察各組大鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的損傷情況；② TUNEL染色觀察各組大鼠海馬CA-1區(qū)凋亡情況；③免疫組化觀察各組海馬CA-1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物（

4、GRP78和XBP-1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡蛋白（CHOP和caspase12）的變化；④Western blot方法檢查各組大鼠腦皮質(zhì)eIF2α、p-eIF2α、CHOP和caspase12蛋白的變化情況。⑤提取各組大鼠腦皮質(zhì)線粒體，化學(xué)發(fā)光法測定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pores，mPTP）變化情況；⑥取各組大鼠腦皮質(zhì)制作單細(xì)胞懸液，化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

5、變化情況；⑦取各組大鼠腦皮質(zhì)組織通過試劑盒檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的變化情況。
　　【結(jié)果】實(shí)驗(yàn)一，心肺復(fù)蘇后，GRP78、XBP-1、CHOP和caspase12的mRNA和蛋白表達(dá)在復(fù)蘇后持續(xù)增加。實(shí)驗(yàn)二，①與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠在復(fù)蘇后24小時(shí)NDS評(píng)分均明顯增高（P<0.01），與DMSO+CP

6、R組相比，Sal+CPR組大鼠NDS評(píng)分顯著降低（P<0.05）；②與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠海馬CA-1區(qū)凋亡的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多（P<0.01）），與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組凋亡的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少（P<0.01））；③與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有不同程度的損傷，與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷明顯減輕；④與sham組

7、相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠海馬CA-1區(qū)GRP78、XBP-1、CHOP和caspase12的表達(dá)明顯增強(qiáng)，與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組減少了XBP-1、CHOP和caspase12的表達(dá)強(qiáng)度，增加了GRP78的表達(dá)；⑤與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠皮質(zhì)線粒體均有不同程度的損傷，但是Sal+CPR組大鼠皮質(zhì)線粒體損傷明顯較DMSO+CPR組減輕；⑥與sham組相比，DMSO+

8、CPR組和Sal+CPR組大鼠皮質(zhì)的p-eIF2α/eIF2α、CHOP和caspase12蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組明顯減少CHOP和caspase12蛋白的表達(dá)（P<0.01），增加p-eIF2α/eIF2α的表達(dá)；⑦與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠皮質(zhì)線粒體mPTP明顯增加（P<0.01），與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組皮質(zhì)線粒體mPTP顯著下

9、降（P<0.01）；⑧與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組大鼠腦皮質(zhì)單細(xì)胞懸液中Ca2+濃度均明顯上升（P<0.01），與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組大鼠腦皮質(zhì)單細(xì)胞懸液中Ca2+濃度均明顯下降（P<0.01）。⑨與sham組相比，DMSO+CPR組和Sal+CPR組的SOD活性下降（P<0.01）；與DMSO+CPR組相比，Sal+CPR組SOD活性增高（P<0.01）。⑩與sham組相比，DMSO+CP