MANF參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在目前常規(guī)武器戰(zhàn)爭中，參戰(zhàn)人員會(huì)身負(fù)的大量戰(zhàn)傷，顱腦損傷為戰(zhàn)爭時(shí)及戰(zhàn)后最致命性的損傷。創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）后有多種繼發(fā)性損害，其中尤以細(xì)胞凋亡為特征的一些改變將會(huì)顯著影響病情的轉(zhuǎn)歸。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)/敏感蛋白MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor)能夠增強(qiáng)細(xì)胞對多種不利因素如無糖狀態(tài)以及其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘因等的耐受性，通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器的活性來改善細(xì)胞生理狀

2、態(tài)，從而減少細(xì)胞凋亡。研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷后的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化以及其干預(yù)措施也許會(huì)成為改善創(chuàng)傷性顱腦損傷預(yù)后的新的臨床切入點(diǎn)。
　　第一部分 MANF在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮質(zhì)表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦皮質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化；探究MANF在顱腦損傷后細(xì)胞凋亡病理過程中的作用；
　　方法：108只Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量：230~280g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中

3、心提供，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為顱腦損傷 TBI組（n=96）和對照Con組（n=12），TBI組采用Feeney’s自由落體撞擊法構(gòu)建模型，對照組不予處理。于傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d八個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，選取大鼠挫傷區(qū)周圍皮質(zhì)腦組織，采用RT-qPCR、和Western blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)選取的標(biāo)本組織中MANF mRNA及其蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化；采用免疫組化染色檢測MANF在挫傷區(qū)周圍皮層腦組織中的分

4、布并測定其累積光密度值；
　　結(jié)果：rt-PCR結(jié)果：皮質(zhì)中MANF mRNA表達(dá)量在TBI后1h升高，6h達(dá)到高峰值，隨即開始下降，14d時(shí)表達(dá)回歸至正常水平，除14d外各時(shí)間點(diǎn)TBI組表達(dá)均高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），MANF免疫組化染色結(jié)果提示其蛋白陽性表達(dá)呈棕褐色或棕黃色，定位在胞質(zhì)，TBI后1h胞質(zhì)中即出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒，6h最明顯，之后各時(shí)間點(diǎn)胞質(zhì)顏色逐漸淡染，14d時(shí)切片與Con組無差異。W

5、estern-blot及免疫組化法檢測的MANF蛋白結(jié)果：TBI后1h開始升高，6h達(dá)到高峰值，14d時(shí)表達(dá)回歸至正常水平，除14d外各時(shí)間點(diǎn)TBI組表達(dá)均高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　結(jié)論：顱腦損傷后MANF陽性表達(dá)定位在胞質(zhì)；MANF mRNA及其蛋白升高可能與細(xì)胞在顱腦損傷時(shí)激活一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有關(guān)，MANF可能參與減少顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 MANF參與

6、缺氧預(yù)處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究
　　第一節(jié)：缺氧預(yù)處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　目的：探討缺氧預(yù)處理(HPC)對創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)大鼠腦皮質(zhì)促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表達(dá)、神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能的影響。
　　方法：健康SD雄性大鼠48只按隨機(jī)數(shù)字表法分為HPC組(給予HPC模型制作)和未HPC組(不予HPC預(yù)處理)，每組24只；然后進(jìn)一步分別按隨機(jī)數(shù)字表法分為

7、對照組(不做任何處理)及TBI后1 d、3 d、7 d組(給予TBI模型制作，按照TBI后不同時(shí)間點(diǎn)觀察、處死并取材)，每組6只。再另取SD大鼠48只，按上述方式分組，用于進(jìn)行mNSS評(píng)分及灌注后取腦用，大鼠在低壓氧倉中進(jìn)行每天3 h、連續(xù)3 d訓(xùn)練以給予HPC，采用改良的Freeny’s法制作TBI模型。對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分(mNSS)，qRT-PCR及Western blotting檢測挫傷區(qū)周圍皮質(zhì)CHOP mRNA

8、及蛋白表達(dá)，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CHOP表達(dá)水平與神經(jīng)元凋亡指數(shù)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：TBI1 d、3 d、7 d組大鼠mNSS評(píng)分、CHOP mRNA和蛋白相對表達(dá)量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組均明顯增高，并在傷后3d時(shí)達(dá)到高峰值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且，HPC組mNSS評(píng)分、CHOP mRNA和蛋白相對表達(dá)量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著低于未HPC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H

9、PC組和未HPC組中TBI1 d、3 d、7 d組CHOP表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(Pearson系數(shù)分別為0.957、0.966)。
　　結(jié)論：HPC通過下調(diào)ERS途徑中CHOP的表達(dá)以減少神經(jīng)元凋亡，從而改善神經(jīng)功能。
　　第二節(jié)：缺氧預(yù)處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠MANF表達(dá)的影響
　　目的：通過觀察缺氧預(yù)處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后挫傷區(qū)周圍 MANF和CHOP的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化的影響，探究MANF參與缺氧預(yù)處理減

10、輕大鼠顱腦損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制。
　　方法：108只Sprague-Dawley雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為缺氧預(yù)處理組和未進(jìn)行缺氧預(yù)處理組，每組54只，然后進(jìn)一步按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組及TBI后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d組(TBI模型制作完成后于對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠)，每亞組各6只。缺氧預(yù)處理組大鼠在低壓氧倉（-50kPa）中進(jìn)行連續(xù)3天、每天持續(xù)3小時(shí)進(jìn)行造模；TBI造模方法同第一部分，HPC結(jié)

11、束后1d行TBI打擊，造模結(jié)束后各亞組中大鼠直接處死，留取腦組織保存于液氮罐中用于行rt-PCR及Western-blot檢測。
　　結(jié)果：MANF mRNA及其蛋白在顱腦損傷后1h就開始上調(diào)，傷后6h達(dá)到高峰值，之后開始下降，傷后7d時(shí)仍高于對照組，傷后14d時(shí)回歸到正常水平，相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CHOP mRNA及其蛋白在傷后1h就開始增高，傷后3d才達(dá)高峰值，之后開始下降，到傷后7d時(shí)表達(dá)仍高于

12、對照組，傷后14d時(shí)回歸到正常水平，相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HPC組大鼠傷后1h-7d各時(shí)間點(diǎn)MANF mRNA及其蛋白相對表達(dá)量均高于未HPC組，HPC組大鼠傷后1h-7d各時(shí)間點(diǎn)CHOP mRNA及其蛋白相對表達(dá)量均低于未HPC組（均P<0.05）。對照組間比較：Con組與HPC組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：缺氧預(yù)處理可使MANF表達(dá)增多，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中CHOP表達(dá)，減少