中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其活性研究.pdf

1、中華鱘(Chinese sturgeon)隸屬脊索動(dòng)物門(mén)、脊椎動(dòng)物亞門(mén)、硬骨魚(yú)綱、硬鱗總目、鱘形目、鱘科、鱘屬,享有“活化石”之盛譽(yù)。中華鱘全身是寶,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,具有獨(dú)特的醫(yī)藥和保健價(jià)值,其中硫酸軟骨素是重要的活性成分之一。經(jīng)研究表明,硫酸軟骨素具有抗氧化、抗凝血、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫等多種生物活性,是目前市場(chǎng)上較為重要的生化藥品和化妝品添加劑,具有重要的研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值。近年來(lái),許多國(guó)家先后開(kāi)展了鱘魚(yú)人工養(yǎng)殖,隨著中華鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)的迅

2、猛發(fā)展,其養(yǎng)殖的年產(chǎn)量迅速增加,我國(guó)現(xiàn)已躍居世界第一養(yǎng)殖大國(guó),這為中華鱘魚(yú)中活性成分的深入研究提供了豐富的資源。目前對(duì)于中華鱘的研究主要集中在養(yǎng)殖方面,關(guān)于深加工方面的研究甚少,對(duì)其中的活性物質(zhì)如硫酸軟骨素主要還是停留在提取階段的研究,還未見(jiàn)中華鱘硫酸軟骨素的純化、結(jié)構(gòu)鑒定、體外抗氧化和抗凝血等研究的相關(guān)報(bào)道。因此,本文主要研究中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的提取、分離和純化方法,并運(yùn)用氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(IR

3、)、核磁共振(NMR)、原子力顯微鏡(AFM)等現(xiàn)代分析手段對(duì)中華鱘軟骨中硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,考察其體外抗氧化和抗凝血活性,為中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 研究中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的提取工藝。采用堿提酶解方法提取中華鱘軟骨中硫酸軟骨素。采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,確定堿提的最佳工藝條件為料液比9.2,NaOH濃度4.4％,提取時(shí)間3.9 h；根據(jù)單因素試驗(yàn),確定酶解的最佳

4、條件為,酶種類選擇胃蛋白酶,加酶量1％,酶解時(shí)間4 h。在此優(yōu)化條件下,硫酸軟骨素得率為26.51±0.30％。
　　 考察咔唑法測(cè)定中華鱘軟骨中硫酸軟骨素含量的方法。以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)計(jì)算樣品中葡萄糖醛酸含量,進(jìn)而轉(zhuǎn)換為硫酸軟骨素含量。D-葡萄糖醛酸在10μg／mL～50μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=0.015 X-0.037(Y為吸光度,X為D-葡萄糖醛酸濃度,μg／mL),相關(guān)系數(shù)r=0.9997,低

5、、中、高三個(gè)不同濃度的加樣回收率分別為100.87％、100.73％和101.29％(n=5),其RSD值分別為2.74％、2.56％和2.22％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法快速,重現(xiàn)性好,可用作中華鱘軟骨中硫酸軟骨素含量的測(cè)定。
　　 研究中華鱘軟骨中硫酸軟骨素的分離純化。采用最優(yōu)工藝制備得到中華鱘軟骨中硫酸軟骨素粗品CS,經(jīng)三氯乙酸除蛋白,DEAE-52纖維素柱純化得到CS-1和CS-2;再經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱純化

6、,得到CS-11和CS-22兩種組分,經(jīng)HPLC檢測(cè)為單一對(duì)稱峰,表明CS-11和CS-22都為均一組分,其相對(duì)分子量分別為13425和42207。
　　 對(duì)中華鱘軟骨CS-11的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。運(yùn)用UV、IR、GC、NMR、AFM等現(xiàn)代分析手段對(duì)CS-11組分進(jìn)行表征。GC用于測(cè)定CS-11的單糖組成,結(jié)果表明,CS-11主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖組成,其摩爾比為葡萄糖:葡萄糖醛酸:N-乙酰氨基半乳糖=0.09

7、:1:0.94；UV分析顯示,CS-11不含有蛋白質(zhì)和核酸；IR分析表明,CS-11具有一般硫酸軟骨素的特征吸收峰,含有乙酰氨基、羧基、硫酸基和糖環(huán)等官能團(tuán),在855 cm-1和819 cm-1存在吸收峰,表明CS-11結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有C4和C6的硫酸基；NMR分析表明CS-11為β構(gòu)型吡喃糖,譜圖中顯示含有乙?；汪然盘?hào)峰；AFM研究CS-11的微觀形態(tài)表明,CS-11分子聚集緊密成團(tuán)。
　　 比較CS粗品和CS-11純品的體

8、外抗氧化和體外抗凝血生物活性。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,CS粗品和CS-11純品對(duì)三種自由基(·OH、DPPH·、ABTS+)均有一定的清除作用。CS粗品對(duì)·OH、DPPH·的清除能力強(qiáng)于CS-11,而CS-11純品對(duì)ABTS+的清除能力強(qiáng)于CS粗品。體外抗凝血實(shí)驗(yàn)表明,CS粗品和CS-11純品均能顯著延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT),且均呈現(xiàn)量效關(guān)系,并且純品抗凝效果顯著優(yōu)于粗品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,