硫酸軟骨素裂解酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其酶固定化方法的研究.pdf

1、硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitinsulfatelyase，ChSase)具有多種藥用價(jià)值，尤其在制備低分子量硫酸軟骨素方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本論文對(duì)ChSase產(chǎn)生菌的篩選、菌株的鑒定及其產(chǎn)酶特性、酶學(xué)性質(zhì)與酶的固定化方法做了系統(tǒng)的研究。 利用快速平板篩選法從鯉魚(yú)魚(yú)腸標(biāo)本中篩選出一株產(chǎn)ChSase活性較高的菌株N235，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)，以及對(duì)該菌株16srRNA基因序列的分析

2、，將菌株N235歸屬為溫和氣單胞菌；對(duì)ChSase的表達(dá)方式和菌株產(chǎn)酶特性的研究表明，ChSase為胞外酶，菌株N235在30℃發(fā)酵36h時(shí)產(chǎn)ChSase活性達(dá)到最高；采用硫酸銨沉淀法制備了粗酶液，并考察了ChSase的酶學(xué)性質(zhì)。 利用制備的粗酶液為原料，分別使用明膠和海藻酸鈉、大孔樹(shù)脂、磁性PF微球?yàn)檩d體，進(jìn)行ChSase固定化方法的研究。結(jié)果表明：(1)明膠和海藻酸鈉協(xié)同包埋固定化ChSase的優(yōu)化條件是：明膠濃度10％，海

3、藻酸鈉濃度2％，氯化鈣濃度4％，加酶量1U/ml體系，交聯(lián)劑戊二醛濃度0.05％-0.07％，交聯(lián)時(shí)間10min；利用此條件獲得的固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度45℃，最適pH7.5，表觀米氏常數(shù)7.06×10-2g/L，具有一定的操作穩(wěn)定性。(2)大孔樹(shù)脂吸附固定化ChSase的優(yōu)化條件是：吸附溫度15℃，吸附時(shí)間6h，吸附pH7.0，加酶量150U/g樹(shù)脂，交聯(lián)劑戊二醛濃度0.01％，交聯(lián)時(shí)間3h，交聯(lián)溫度4℃；利用此條件獲得的固定

4、化酶的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度40℃-50℃，最適pH7.0，表觀米氏常數(shù)1.46×10-1g/L，具有較好的操作穩(wěn)定性。(3)磁性PF微球固定化ChSase的優(yōu)化條件是：對(duì)苯二酚8.2g，甲醛15ml，鹽酸2ml制備PF凝膠；PF凝膠1.5g制備磁性PF微球；固定溫度20℃、固定時(shí)間8h、加酶量67.3U/g磁性PF微球制備固定化酶；利用此條件制備的固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度50℃，最適pH8.0，表觀米氏常數(shù)5.23×10-1g/L