一種新型硫酸軟骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究.pdf

1、糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）是一類在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的多糖，并且與多種疾病息息相關(guān)。硫酸軟骨素AC外切酶(chondroitinsulfate AC lyase，ChnAC，EC4.2.2.5)可以降解包括硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)在內(nèi)的多種GAGs，生成非還原端包含4-不飽和葡糖醛酸的相應(yīng)二糖。研究發(fā)現(xiàn)，多種野生微

2、生物可以表達(dá)ChnAC，這些酶的編碼基因大部分已經(jīng)確定。天然或者重組表達(dá)的微生物來(lái)源的ChnAC作為降解工具酶被并廣泛的應(yīng)用于GAGs糖鏈結(jié)構(gòu)研究和序列分析。
　　本課題的主要內(nèi)容包括:
　　1.本課題組此前從土壤中篩選到一株高產(chǎn)硫酸軟骨素降解酶(chondroitinsulfate lyase，ChSase)的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)菌株SSAs-1。通過(guò)分子生物學(xué)手段克隆該菌株表達(dá)ChSase的編碼基

3、因AsChnAC。首先設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增得到中間部分基因序列;然后通過(guò)inverse PCR方法得到下游基因序列;通過(guò)Genome Walking技術(shù)得到上游基因序列;最后序列分析確定該基因起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)，確定編碼ChSase的基因序列的開(kāi)放閱讀框架。
　　2.實(shí)現(xiàn)AsChnAC基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效重組表達(dá)，并優(yōu)化了該基因編碼的蛋白的誘導(dǎo)和純化條件。
　　3.通過(guò)氨基酸殘基序列同源比

4、對(duì)分析和純化酶分子底物特異性分析，確定本課題自節(jié)桿菌SSAs-1克隆獲得的ChSase為硫酸軟骨素AC外切酶ChnAC，并命名為AsChnAC。
　　4.系統(tǒng)分析了該新型AsChnAC的酶學(xué)參數(shù)，以化學(xué)酶法合成的結(jié)構(gòu)確定的寡糖系列底物首次確定了ChSase對(duì)底物糖鏈的酶解方向。盡管微生物ChnAC的底物特異性和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)已有一定的研究基礎(chǔ)，但由于結(jié)構(gòu)均一確定模式底物的缺乏，使其降解糖鏈的催化方向性仍然未知。本課題首次利用化學(xué)酶

5、法寡糖合成技術(shù)制備了四種肝素-軟骨素嵌合寡糖底物，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)分析了AsChnAC處理四種寡糖的降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AsChnAC可以降解位于底物寡糖糖鏈還原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-單位;然而當(dāng)-GlcNAc-α1,4-GlcA-單位位于寡糖糖鏈的還原端時(shí)，卻阻礙了AsChnAC降解寡糖糖鏈中間和非還原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-單位。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接證明了ChnAC對(duì)底物的催