基于整合素α4β7的藥物篩選和候選藥物作用機(jī)制初步研究.pdf

1、目的:整合素(integr-in)是表達(dá)于細(xì)胞膜上,由α/β異二聚體通過非共價(jià)鍵結(jié)合形成的膜受體。整合素在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥中起重要作用,可以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向病灶部位的遷移和聚集。目前整合素家族有多個(gè)成員,其中α4β7在腸道炎癥中起主導(dǎo)作用。目前已經(jīng)確定與α4β7有關(guān)的腸道炎癥疾病包括克羅恩病(Crohn's disease),潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)等。α4β7的主要配體為黏膜地址素細(xì)胞粘附分子(mucosa

2、l addressin cell adhesionmolecule-1,MADCAM-1)。MAdCAM-1是選擇性表達(dá)于黏膜淋巴器官高內(nèi)皮靜脈和腸道同有層靜脈的一種跨膜糖蛋白分子。炎癥情況下,多種細(xì)胞因子可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)MAdCAM-1,然后MAdCAM-1介導(dǎo)表達(dá)α4β7的白細(xì)胞向炎癥部位遷移。無論是靶向整合素α4β7或者是MAdCAM-1都可以減輕腸道炎癥程度。目前市場(chǎng)上并沒有針對(duì)α4β7所介導(dǎo)炎癥的特異性小分子化合物,I臨

3、床上使用的Natalizumab是一種人源化的單克隆抗體,靶點(diǎn)為α4亞基,主要用于治療多發(fā)性硬化癥和克羅恩病。本課題主要通過篩選影響α4β7和MAdCAM-1相互作用的化合物,其一為尋找特異性小分子抑制劑,開發(fā)臨床用藥,其二通過研究篩選的抑制劑或激動(dòng)劑作用更好的了解α4β7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以便為開發(fā)更好的特異性藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的含有MAdCAM-1全長并融合有Fc片段的質(zhì)粒pcD

4、NA3-MAdCAM-1-Fc構(gòu)建新質(zhì)粒pEF-1-MAdCAM-1-Fc并建立293T穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Western blot方法挑選并鑒定高表達(dá)MAdCAM-1-Fc穩(wěn)轉(zhuǎn)株。培養(yǎng)收集穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞培養(yǎng)基上清,通過Protein A柱子純化MAdCAM-1-Fc融合蛋白。Protein A粗純的靶蛋白含有雜蛋白,用AKTA Purifier進(jìn)行進(jìn)一步純化。純化的MAdCAM-1-Fc蛋白包被96孔ELISA酶標(biāo)板用于基于細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的藥物篩選:<

5、br>　　 2.基于細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)的藥物篩選選用高表達(dá)α4β7的RPMI8866細(xì)胞,用熒光染料BCECF-AM處理RPMI8866細(xì)胞,然后和不同化合物在包有MAdCAM-1-Fc的ELISA板里共孵育30分鐘后洗去未結(jié)合或者若弱結(jié)合的細(xì)胞,最后用熒光儀器進(jìn)行熒光讀數(shù);
　　 3.對(duì)篩選出的候選藥物通過細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行IC50測(cè)定;
　　 4.Flow chamber assay對(duì)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)篩選出的候選藥物進(jìn)行進(jìn)一步

6、的驗(yàn)證;
　　 5.Western blot檢測(cè)離子霉素在RPMI8866細(xì)胞中對(duì)磷酸化Paxilin和磷酸化FAK的蛋白量影響;
　　 6.免疫共沉淀檢測(cè)在離子霉素作用下talin-α4β7的相互作用狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)鑒定共篩出3株高表達(dá)MAdCAM-1-Fc的細(xì)胞株,分別為1F4,3C8和3F9;
　　 2.通過對(duì)8個(gè)種類的藥物庫共計(jì)2100多種化合物的篩選,共找到五個(gè)候選化合

7、物,分別為離子霉素(ionomycin),雷帕霉素(Rapamycin),AG879,Tyrphostin A9,SU1498。
　　 3.細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定四種化合物(Rapamycin為激活劑)的IC50分別為:離子霉素(5.5μM),AG879(14.18μM),TyrphostinA9(11.2μM),SU1498(15.12μM)。
　　 4.Flow chamber assay實(shí)驗(yàn)中觀察到在50μM的情況下,離

8、子霉素對(duì)RPMI8866細(xì)胞和MAdCAM-1結(jié)合有抑制作用。而AG879,Tyrphostin A9和SU1498在10μM的情況下沒有觀察到明顯的抑制現(xiàn)象,雷帕霉素在10μM的情況下沒有觀察到明顯的激活現(xiàn)象。
　　 5.western blot結(jié)果顯示,離子霉素可以抑制paxilin和FAK的磷酸化。
　　 6.免疫共沉淀結(jié)果顯示離子霉素抑制了Talin與α4β7的結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 1.離子

9、霉素為一種特異性鈣離子通道藥,可以介導(dǎo)胞外鈣離子向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離了濃度可以訓(xùn)節(jié)整合素α4β7的活性。雷帕霉素在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中觀察到激活作用,在Flow chamber assay中沒有觀察到激活作用;AG879,Tyrphostin A9和SU1498在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中觀察到抑制現(xiàn)象,但在后續(xù)的Flow chamber assay中并沒有觀察到抑制作用。這可能歸結(jié)于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境不一樣,細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中藥物在MADCAM-1配體

10、存在的情況下和藥物在37度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘,而Flow chamber assay中藥物處理細(xì)胞是在沒有配體存在的情況下進(jìn)行的。其次,Flow chamber Assay是比細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)靈敏度高得多的技術(shù),這也是我們?yōu)楹芜x擇這種方法進(jìn)行藥物驗(yàn)證的原因。
　　 2.研究證實(shí)Paxilin,黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和Talin在整合素介導(dǎo)的黏著癍(Focal adhesion comple