基于模擬微血流狀設計藥物篩選模型的初步研究.pdf

1、近十幾年來新藥的數(shù)量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，面對著周期長、成本高且成功率低的迫切問題，何種策略對新藥研發(fā)是行之有效的，一直是個爭論不休的話題。盡管有大量的活性物質(zhì)在體外篩選中被發(fā)現(xiàn)，然而令人費解的是很多在體外藥理活性高的化合物一旦在進入動物或臨床試驗后往往藥效差強人意，這也就導致了許多候選藥物在后期研發(fā)中被淘汰。然而，引起這種活性差異的原因仍然是一個“黑匣子”，這也成為了現(xiàn)代藥物研發(fā)中關(guān)注的焦點，是值得我們深入探究的問題。
　　

2、藥物在體外篩選與體內(nèi)發(fā)揮作用的真實環(huán)境差異可能是其中的原因之一，一個最明顯區(qū)別就是體外的靜態(tài)篩選與體內(nèi)的動態(tài)環(huán)境之差。藥物進入體內(nèi)一般會經(jīng)過吸收、分布、代謝等過程來發(fā)揮作用，然而這些過程都與血液循環(huán)系統(tǒng)密切相關(guān)，特別是微循環(huán)系統(tǒng)作為機體進行物質(zhì)交換的場所，它是否在引起這種體內(nèi)外藥物活性差異中扮演著什么重要角色?；诖?，本實驗以內(nèi)皮細胞為研究對象，丹參為模型藥物，借助于流動腔加載以實現(xiàn)模擬在體微血流的流動環(huán)境，擬初步建立一種動態(tài)的藥物篩選

3、方法，以考察動態(tài)篩選與靜態(tài)篩選之間是否存在細胞對藥物吸收和代謝的差異。生物力學及生物力藥理學的迅速發(fā)展為提出一種新的動態(tài)篩選策略提供了強大的理論依據(jù)。
　　 本課題的主要研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下所示：
　　 ①基于在體微血管的生理環(huán)境(1～5dyn/cm2剪切力直接作用于內(nèi)皮細胞)，建立了一套體外模擬微血流的系統(tǒng)，由平板流動腔、恒流泵、硅膠管和儲液瓶構(gòu)成。該系統(tǒng)能提供二維穩(wěn)定的分散狀層流。通過對流動系統(tǒng)的校正，得到恒流泵各

4、轉(zhuǎn)速與對應的流體流量之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999。采用烏氏粘度計測得灌流液在37℃下的粘度為6.684x10-3dyn·s/cm2，并根據(jù)剪切力公式，擬合恒流泵各轉(zhuǎn)速與對應剪切力之間良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999。并推算出實驗所需的微血流剪切力τ=1.5 dyn/cm2，3.0 dyn/cm2和4.5dyn/cm2時，對應的轉(zhuǎn)速分別為0.18rpm，0.28rpm和0.38rpm。
　　 ②以丹參提取

5、物作為模型藥物，考察了不同濃度的丹參提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)對內(nèi)皮細胞活力的影響，實驗結(jié)果表明100μg/mL～400μg/mL對細胞活力有顯著影響，并在100μg/mL達到最大活力119.50％，相對于正常對照組活力提高了19.50％。將丹參提取物原液進行LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)12個物質(zhì)峰，通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)及參考丹參成分的相關(guān)文獻，從中推斷出11個成分

6、，包括丹參素、丹酚酸A、丹酚酸J、咖啡酸、二氫丹參酮Ⅰ、丹酚酸B、迷迭香酸甲酯、丹酚酸D、原兒茶醛、亞甲基丹參醌和迷迭香酸，以及一個未知成分。通過對給藥后靜態(tài)模型和動態(tài)模型的細胞解離液進行LC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)它們都對丹參素、二氫丹參酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亞甲基丹參醌、丹酚酸D和丹酚酸A這7個成分有吸收，這些成分可能與血管活性的功效有關(guān)；另外，與靜態(tài)模型相比，在動態(tài)模型的細胞解離液中，發(fā)現(xiàn)一個未知成分峰，通過與空白細胞解離液和藥材原液譜

7、圖比較均未發(fā)現(xiàn)，推測其可能是藥物與細胞在微血流條件下作用后產(chǎn)生的某種代謝物。在微血流的給藥時間梯度(1h、2h、3h)考察下，動態(tài)模型均對這7個成分有吸收，而且在不同加載時間的作用下于不同時間各出現(xiàn)一個未知成分峰，通過譜圖對比，推測這些未知成分可能為代謝物。由此可見，相對于靜態(tài)細胞模型來說，在微血流擬態(tài)下，細胞對藥物的吸收代謝是有影響的，并且隨著藥物作用時間的增加，對其吸收代謝會產(chǎn)生不同的影響。
　　 ③通過考察靜態(tài)模型(τ=0

8、)、恒流模型(τ=1.5dyn/cm2)和梯度流模型(τ=1.5-3.0-4.5 dyn/cm2)三種不同給藥情況下，細胞對藥物吸收代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均對丹參提取物中的7個成分有吸收，包括丹參素、二氫丹參酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亞甲基丹參醌、丹酚酸D和丹酚酸A。然而在恒流模型中出現(xiàn)1個未知成分峰，在梯度流模型的細胞解離液中發(fā)現(xiàn)了3個未知成分峰，通過與空白細胞解離液和藥材原液譜圖比較均未發(fā)現(xiàn)，推測這些未知成分可能為藥物與細胞在微血流

9、條件下作用后產(chǎn)生的某種代謝物，而靜態(tài)模型沒有未知成分峰的出現(xiàn)。由此可推斷，與靜態(tài)相比較，在微血流條件下動態(tài)的藥物篩選環(huán)境會影響細胞對藥物的吸收代謝，并且梯度流的剪切力這種影響作用更明顯。
　　 ④通過考察H2O2不同濃度(75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L、600μmol/L、1200μmol/L)作用于內(nèi)皮細胞不同時間(0.5h、1h、2h)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2300μmol/L～1200μmol/L讓細胞

10、活性明顯下降，與正常對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中300μmol/L的H2O2刺激0.5h，細胞活性抑制率達到27.94％，以此建立氧化損傷模型。在一定的實驗濃度范圍，考察了不同濃度的丹參提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)對內(nèi)皮細胞的抗氧化效應，研究表明200μg/mL的丹參提取物對細胞的保護作用最強，細胞活性達到了113.64％。基于上述實驗，

11、在微血流擬態(tài)下觀察到經(jīng)200μg/mL丹參提取物預處理后再與H2O2作用的細胞，其形態(tài)比損傷組有較明顯的改善，說明動態(tài)模型篩選丹參中抗氧化活性成分是可行的，并且丹參提取物在動態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)下對細胞的保護作用還是有差異的。在動態(tài)模型下，從細胞解離液中，分析鑒定出5個丹參活性成分，包括丹參素、丹酚酸B、丹酚酸D、咖啡酸、二氫丹參酮Ⅰ，和2個未知成分峰；而靜態(tài)模型中，只有4個成分被細胞吸收，比動態(tài)少了二氫丹參酮Ⅰ的吸收和1個未知成分峰，通過與空