基于微流控系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析及相關(guān)藥物篩選.pdf

1、前言
　　 轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為之一,也是影響腫瘤患者預(yù)后并導(dǎo)致治療失敗的主要因素。轉(zhuǎn)移是發(fā)生在腫瘤宿主內(nèi)一系列復(fù)雜過程的最終結(jié)果,其中腫瘤侵襲細(xì)胞外基質(zhì)是轉(zhuǎn)移形成中多個步驟中最關(guān)鍵的一步,是轉(zhuǎn)移的前奏[1,2]。建立能夠模擬腫瘤侵襲力的檢測分析方法對認(rèn)識腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,進(jìn)行相關(guān)藥物篩選具有重要意義。早期發(fā)展的檢測侵襲力的方法主要利用含有基底膜的各種天然組織作為實驗?zāi)Ｐ?在此基礎(chǔ)上,Albini[1]等人將人工基質(zhì)膠

2、包被于帶有微孔的膜上,構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞侵襲力分析的體外模型,稱為勃頓小室法(Boydenchamber)或Transwell小室法。該模型是目前腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物篩選中應(yīng)用最為廣泛的方法,培養(yǎng)小室已被商品化。但該方法的檢測過程包含多個手工操作步驟,易造成檢測誤差,難以準(zhǔn)確定量細(xì)胞數(shù)量,同時也不適合對細(xì)胞侵襲行為進(jìn)行動態(tài)觀察和監(jiān)測。
　　 微流控芯片技術(shù)是一種新的微型分析系統(tǒng),利用微加工技術(shù)可以在厘米大小的芯片上刻蝕出微

3、米尺寸的反應(yīng)管道,微型化的結(jié)構(gòu)尺寸更利于模擬生物體內(nèi)環(huán)境以進(jìn)行細(xì)胞的相關(guān)分析,此外,微流控芯片還具有對多個分析過程進(jìn)行自動化、集成化控制的優(yōu)勢,進(jìn)而可以提高整個分析過程的準(zhǔn)確性和速度。本研究擬建立基于微流控的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析系統(tǒng),定量評價細(xì)胞的侵襲能力,并與圣誕樹形梯度發(fā)生器集成,利用二者形成的垂直方向和水平方向的雙向梯度,進(jìn)行抗腫瘤侵襲藥物的篩選。
　　 實驗材料及方法
　　 芯片的基本設(shè)計思想是在完成細(xì)胞侵襲力分析

4、的同時實現(xiàn)相關(guān)藥物的篩選。芯片結(jié)構(gòu)包括供細(xì)胞侵襲力分析的三條基本通道即細(xì)胞通道、基質(zhì)膠通道和條件培養(yǎng)基通道,以及供藥物篩選的圣誕樹型梯度發(fā)生器。通過流體控制在細(xì)胞通道-基質(zhì)膠通道-條件培養(yǎng)基通道之間形成細(xì)胞遷移所需的垂直方向濃度梯度。通過與樹狀梯度生成器的連接可在細(xì)胞通道形成水平方向的藥物濃度梯度用來進(jìn)行抗侵襲藥物篩選。
　　 選用AZ-P4620正光刻膠軟光刻法制作陽模,再將PDMS預(yù)聚物和固化劑以10:1(m/m)的比例混合

5、均勻,澆灌在陽模上。抽真空30min除氣,然后在85℃的烘箱中,固化30min,將PDMS從陽模板上剝離,等離子體處理后與玻璃進(jìn)行封接,即可完成芯片制作。
　　 對芯片進(jìn)行一定處理后,在基質(zhì)膠通道內(nèi)注入膠原,37℃固化2小時后,真空除氣通入不同的液體。首先對芯片內(nèi)濃度梯度形成條件進(jìn)行優(yōu)化,即在樹狀梯度生成區(qū)的兩個入口分別通入藍(lán)色和紅色染料,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入透明水溶液,觀察和記錄芯片內(nèi)梯度形成;在優(yōu)化的梯度形成條件下進(jìn)行細(xì)胞

6、培養(yǎng),取對數(shù)生長期的不同細(xì)胞,胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL注入芯片細(xì)胞通道,在樹狀梯度生成區(qū)的兩個入口均通入含10%血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,連續(xù)觀察并記錄細(xì)胞的生長狀態(tài);應(yīng)用優(yōu)化的芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)條件,進(jìn)行細(xì)胞侵襲力的分析檢測,即在樹狀梯度生成區(qū)兩入口均通入無血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基以形成垂直方向的梯度。連續(xù)觀察細(xì)胞侵入基質(zhì)膠的情況,并采用軟件計算細(xì)胞侵襲面積及前

7、導(dǎo)細(xì)胞遷移距離,定量評價細(xì)胞侵襲能力;為驗證系統(tǒng)功能,在樹狀梯度生成區(qū)的兩個入口分別通入含10%血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,在樹狀梯度生成區(qū)域產(chǎn)生水平方向的0～10%的血清梯度,并與條件培養(yǎng)基通道內(nèi)含10%血清的培養(yǎng)基形成垂直方向的梯度,觀察細(xì)胞在雙向血清梯度條件下的侵襲情況;取抗腫瘤藥物十字胞堿,用無血清培養(yǎng)基配制成0.2μM濃度,將含有藥物的培養(yǎng)基溶液和正常無血清培養(yǎng)基注入樹狀濃度梯度生成區(qū)

8、域,在芯片內(nèi)形成沿細(xì)胞通道方向分布的連續(xù)藥物濃度梯度;取高侵襲性SGC-7901細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞注入細(xì)胞通道,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,形成垂直方向的血清梯度,連續(xù)觀察藥物作用下,芯片水平方向不同位置細(xì)胞侵入基質(zhì)膠的情況,并通過測量侵襲面積和前導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動距離進(jìn)行定量評價。
　　 實驗結(jié)果
　　 一、芯片的制作與濃度梯度形成
　　 采用光刻法成功制作PDMS芯片。優(yōu)化芯片內(nèi)濃度梯度形

9、成條件,結(jié)果顯示,在不同流速下考察芯片內(nèi)的梯度形成狀況。在Q=3μL/hr流速下,能夠快速形成實驗所需的雙向濃度梯度,且能夠長時間穩(wěn)定維持。
　　 二、芯片內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)
　　 實驗采用多種細(xì)胞系進(jìn)行長時間培養(yǎng),結(jié)果表明包括正常和腫瘤細(xì)胞的多種不同細(xì)胞在芯片內(nèi)均能正常生長并增殖。證實了芯片的細(xì)胞培養(yǎng)能力。
　　 三、芯片內(nèi)的細(xì)胞侵襲力檢測及定量分析
　　 采用具有不同侵襲能力細(xì)胞系進(jìn)行芯片侵襲力檢測,分別為

10、無侵襲性的人胚腎細(xì)胞系HEK-293、中低侵襲性腸癌細(xì)胞系SW-480、中低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、中侵襲性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、高侵襲性胃癌細(xì)胞系SGC-7901。結(jié)果顯示,腫瘤細(xì)胞均不同程度進(jìn)入基質(zhì)膠通道,其中高侵襲胃癌細(xì)胞系SGC-7901運(yùn)動現(xiàn)象最為明顯,甚至有細(xì)胞進(jìn)入到條件培養(yǎng)基通道,中低侵襲細(xì)胞系運(yùn)動進(jìn)入基質(zhì)膠通道但并未進(jìn)入條件培養(yǎng)基通道,且不同細(xì)胞系之間存在一定差別。通過連續(xù)的觀察,可以看到各種具有不同侵襲能力的細(xì)胞

11、系每天的運(yùn)動變化情況。證實了該芯片系統(tǒng)能夠應(yīng)用于不同細(xì)胞的侵襲運(yùn)動檢測以及同種細(xì)胞在不同作用下的運(yùn)動變化檢測。
　　 實驗結(jié)果通過測量侵襲面積和前導(dǎo)細(xì)胞侵襲距離的方法進(jìn)行了定量分析。兩種方法的分析結(jié)果基本一致,能夠顯示出高、中、低侵襲性細(xì)胞系之間的差異。
　　 四、采用芯片系統(tǒng)進(jìn)行抗侵襲藥物的篩選
　　 為了對系統(tǒng)功能性進(jìn)行檢測考查系統(tǒng)是否可以形成垂直方向和水平方向的雙向血清梯度,實驗使用高侵襲細(xì)胞系SGC-79

12、01細(xì)胞作為模式細(xì)胞。在細(xì)胞通道內(nèi)使用無血清和含10%血清的培養(yǎng)基形成水平方向的濃度梯度,并與條件培養(yǎng)基通道內(nèi)的含10%的培養(yǎng)基形成垂直方向的濃度梯度。實驗結(jié)果顯示,沿芯片水平方向侵入基質(zhì)膠通道的細(xì)胞逐漸減少,說明該系統(tǒng)在水平方向及垂直方向均可形成功能性梯度。
　　 藥物篩選實驗部分,選用0～0.2μM十字胞堿藥物梯度分別作用SGC-7901細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞。對SGC-7901細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分析,顯示隨著藥物濃度的增

13、加,細(xì)胞的侵襲運(yùn)動受到不同程度的抑制,且該抑制作用與藥物的濃度呈現(xiàn)正相關(guān),并表現(xiàn)出明顯的藥物濃度依賴性,即該系統(tǒng)可定量篩選和評價藥物的抗侵襲能力。對MDA-MB-231細(xì)胞的作用結(jié)果同樣可以檢測出隨藥物濃度的增加細(xì)胞的侵襲逐漸受到抑制,此外,通過熒光染色可同時觀察到藥物具有的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 結(jié)論
　　 本研究建立了基于微流控的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析系統(tǒng),實現(xiàn)了對不同侵襲能力腫瘤細(xì)胞的定量分析:通過建立雙向、連續(xù)濃度梯度