基于微流控芯片的膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞的特異性捕獲.pdf

1、目的:
　　借助全新膀胱癌特異性單克隆抗體BCMab1、生物素-親和素系統(tǒng)及微流控芯片技術，設計并制作膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞特異性篩選芯片，實現(xiàn)對膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞的特異性捕獲，并探討影響芯片捕獲靶細胞的因素。
　　方法:
　　1.篩選芯片的設計:借助計算機輔助設計軟件設計篩選芯片。整個篩選芯片由上下兩部分組成，且每部分均有微結構，上部分為魚骨結構，用于改變流體性狀，下部分為微通道結構，用于捕獲靶細胞。
　　2.篩選

2、芯片的制作:制作硅片模板、用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作基片、修剪、打孔、清洗處理，等離子處理鍵合封接上下兩部分，制成篩選芯片。
　　3.篩選芯片的表面修飾:首先，將鏈霉親和素包被到微通道內(nèi);其次，對膀胱癌單克隆抗體BCMab1進行生物素化修飾;最后，將生物素化的抗體灌入微通道內(nèi)，鏈霉親和素與生物素化抗體結合，最終形成鏈霉親和素-生物素-抗體系統(tǒng)。
　　4.樣本液的制備:取膀胱癌細胞T24作為靶細胞，實驗前用熒光染料5(6

3、)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)按說明對靶細胞進行熒光標記。取得實驗參與者知情同意，取健康人外周血，用生理鹽水稀釋10倍。將標記的膀胱癌細胞T24加入到稀釋10倍的人外周血液中，并根據(jù)實驗需要制備不同細胞濃度的樣本液。
　　5。芯片的設計分組:在實驗中，為了研究抗體對靶細胞是否具有捕獲作用，根據(jù)芯片表面抗體包被情況，將芯片制作成兩種:有魚骨結構及BCMab1抗體的芯片;有魚骨結構無BCMab1抗體的芯片。

4、　　6.芯片捕獲靶細胞:將60μ l、靶細胞濃度為5000個/ml的樣本液以流速為10μl/min分別泵入到有魚骨結構及BCMab1抗體的芯片和有魚骨結構無BCMab1抗體的兩組芯片中，沖洗后，于顯微鏡下觀察，計數(shù)，統(tǒng)計捕獲率。
　　7.探討影響芯片捕獲靶細胞的因素:①為了探討流速對芯片捕獲率的影響，將60μl、濃度為5000個/ml的樣本液分別以流速為10、15、20、25和30μ l/min泵入到含有抗體及魚骨結構的芯片中;②

5、為了探討細胞濃度對芯片捕獲率的影響，將細胞濃度為500、5000和50000個/ml的樣本液，以10μ l/min的速度泵入到含有抗體及魚骨結構的芯片通道內(nèi)進行篩選;③為研究魚骨結構對芯片捕獲靶細胞的影響，我們設計了兩種不同的芯片，即含有魚骨結構和未含有魚骨結構的芯片，二者均包被BCMab1抗體，將60μl細胞濃度為5000個/ml的樣本液，借助注射泵，以流速為10μ l/min分別泵入到有魚骨結構及BCMab1抗體的芯片和無魚骨結構有

6、BCMab1抗體的芯片，沖洗后，于顯微鏡下觀察，計數(shù)。
　　結果：
　　1.制作成特異性篩選膀胱癌循環(huán)腫瘤細胞的微流控芯片，大小為40mm×5mm×3mm。芯片上下兩層，上層為魚骨樣結構，寬50μm，高45μm，相鄰兩個魚骨結構之間的間距為100～300μ m;下層為微通道，微通道高為50μm。
　　2.高倍顯微鏡下觀察到，含有抗體及魚骨結構的芯片對膀胱癌細胞T4具有明顯的捕獲作用。包被有BCMab1抗體的芯片對靶細胞

7、捕獲平均(20.8±6.3)個，未含抗體的芯片對靶細胞捕獲為平均(1.2±1.1)個，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.在不同細胞濃度下，芯片對靶細胞的捕獲率維持在89％左右。隨著流速的增加芯片對靶細胞的捕獲率下降;當流速在10μ l/min時，無論是含有魚骨結構的篩選芯片還是不含魚骨結構的篩選芯片，對靶細胞的捕獲率最大。在同一流速下，含有抗體及魚骨結構的芯片捕獲率明顯高于含有抗體而未含有魚骨結構的芯片捕獲率為(P＜