微流控芯片平臺上細(xì)胞捕獲及藥物作用分析方法研究.pdf

1、細(xì)胞是生物體最基本的結(jié)構(gòu)單元和功能單元,細(xì)胞的研究是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ),對人類的發(fā)展具有重大的意義。對細(xì)胞的形態(tài)、繁殖與分化、衰老與凋亡、遷移、細(xì)胞間的信息傳遞、細(xì)胞的分泌排泄等生命活動的研究有助于探索生命活動的規(guī)律與本質(zhì)、疾病的診斷與治療。但是常規(guī)的細(xì)胞研究方法存在以下幾個難點:(1)細(xì)胞的尺寸微小,難于操縱；(2)細(xì)胞內(nèi)成份復(fù)雜且含量微小,并包含有大量的生物學(xué)信息,需要高通量的分析和高靈敏度的檢測手段；(3)傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法無法提

2、供復(fù)雜、微尺度的生長環(huán)境。而微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn),從很大程度上克服了這些難點。微流控芯片由于自身微尺寸的特點,具有試劑消耗量小、分析速度快、便于集成化,微型化和自動化程度高等優(yōu)勢,已被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。近年來,微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞分析中的研究受到了越來越廣泛的關(guān)注。
　　 本論文針對生命科學(xué)領(lǐng)域中對細(xì)胞分析的迫切要求,同時為了解決常規(guī)細(xì)胞分析方法中遇到的一些問題,在微流控芯片上開展了以細(xì)胞為基礎(chǔ)的疾病診斷和藥物

3、開發(fā)的相關(guān)研究。具體開展了以下四個方面的工作:
　　 1、微流控芯片上基于免疫磁珠法分選CD4+T淋巴細(xì)胞用于艾滋病的診斷。在微流控芯片上通過靈活設(shè)計含有擴(kuò)大反應(yīng)室的Y型微通道,并結(jié)合一步免疫磁珠法捕獲和分離CD4+T淋巴細(xì)胞,并對其計數(shù)。實驗中以小鼠胸腺中提取的細(xì)胞懸液作為樣品,首先在外加磁場的作用下將包被有CD4抗體的免疫磁珠固定在微通道的反應(yīng)室中,然后利用免疫磁珠表面的CD4抗體與細(xì)胞表面的CD4抗原之間的特異性免疫反應(yīng)將

4、CD4+T淋巴細(xì)胞捕獲并分離。CD4+T淋巴細(xì)胞的計數(shù)只需一個普通的顯微鏡即可完成。此外,實驗中使用的Y型微流控芯片,將截面積放大的反應(yīng)室的兩個末端設(shè)計成對稱的圓錐形,是為了減小液體的死體積,有助于細(xì)胞的捕獲。實驗中為了獲得最大的細(xì)胞捕獲效率,對反應(yīng)室的截面積和細(xì)胞懸液的進(jìn)樣流速進(jìn)行了優(yōu)化,實驗過程中無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理,并且整個分析時間只需約15分鐘。研究結(jié)果表明,建立的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)平臺能應(yīng)用于艾滋病的診斷,并能極大地降低醫(yī)

5、療費(fèi)用,適合于資源匱乏的地區(qū)推廣使用。
　　 2、微流控芯片上基于水凝膠包裹的細(xì)胞用于抗癌藥物分析。將微流控芯片與紫外可控光聚合聯(lián)用,利用熒光倒置顯微鏡在微通道中加工出位置和形狀可控的三維水凝膠微結(jié)構(gòu)。利用該技術(shù)將人肝癌HepG2細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞同時固定在微通道的同一個水凝膠微陣列中,并用不同的水凝膠微結(jié)構(gòu)形狀加以區(qū)別。在同一微通道中還可以加工出含有多種活細(xì)胞的水凝膠微陣列,有助于進(jìn)行高通量的細(xì)胞分析。實驗中我們研究了光

6、刻法加工水凝膠微結(jié)構(gòu)的過程中,預(yù)聚物的組成和紫外照射時間對光交聯(lián)的水凝膠內(nèi)包裹細(xì)胞的活性影響。通過優(yōu)化條件,細(xì)胞的活性幾乎能達(dá)到100％。對水凝膠包裹的細(xì)胞進(jìn)行長時間的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞能保持至少三天的活性,因而能用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測。此外,用兩種抗癌藥對水凝膠包裹的HepG2和A549細(xì)胞進(jìn)行刺激并誘導(dǎo)其凋亡,研究了細(xì)胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的谷胱甘肽和活性氧自由基兩個氧化還原參數(shù)的變化。研究結(jié)果顯示,這兩種抗癌藥對兩種細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和活性

7、氧自由基的影響程度不同,而放線菌素D對HepG2細(xì)胞的作用效果最為明顯,證明了藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有選擇性。該平臺提供了一個簡單、快速、且高通量的分析方法用于監(jiān)測抗癌藥物對腫瘤細(xì)胞的影響,在基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中具有遠(yuǎn)大的應(yīng)用價值。
　　 3、開發(fā)了一種微流控芯片與質(zhì)譜聯(lián)用的新技術(shù)用于藥物代謝的研究。該微流控芯片上包含兩個不同功能的單元結(jié)構(gòu):(1)用于細(xì)胞培養(yǎng)的圓形小室；(2)質(zhì)譜檢測前用于樣品除鹽和富集的固相萃取微柱。將兩個不同的功

8、能單元通過聚乙烯管相連,從而將藥物代謝相關(guān)的操作單元如細(xì)胞培養(yǎng)、藥物刺激、代謝物的產(chǎn)生、樣品的預(yù)處理和檢測同時集成到一個微流控設(shè)備上。為了評價該平臺進(jìn)行藥物代謝研究的可行性,以維生素E在A549細(xì)胞內(nèi)的代謝為模型進(jìn)行了驗證。實驗中用ESI-Q-TOF質(zhì)譜成功的檢測到了兩種代謝產(chǎn)物,且整個檢測時間只需要8分鐘。通過集成多個平行的微通道,能同時完成多個樣品的除鹽和富集,且整個樣品預(yù)處理的時間僅需約15分鐘,所消耗的溶劑量不到100μL。研究

9、結(jié)果表明,建立的芯片與質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)平臺在新藥開發(fā)過程中具有很大的應(yīng)用潛力。
　　 4、設(shè)計了一個集成化的微流控芯片,可以同時進(jìn)行高通量的細(xì)胞毒性篩選和ESI-Q-TOF質(zhì)譜對藥物吸收和代謝物的在線檢測。微流控芯片由濃度梯度發(fā)生器、相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)室微陣列、以及集成在芯片上的固相萃取柱構(gòu)成。通過這個聯(lián)合體系可以同時完成諸如液體的擴(kuò)散和混合,細(xì)胞的培養(yǎng)、刺激、標(biāo)記、藥物的吸收以及代謝物的生成。實驗中用抗癌藥甲氨蝶呤為模型藥物對該平臺