微流控芯片細胞鈣信號研究.pdf

1、鈣離子是一種普遍的細胞內(nèi)信使，其濃度的時空變化及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)控基因的表達，從而影響甚至決定細胞的行為。所以，研究單細胞鈣信號以及鈣信號在細胞間的傳遞對于揭示眾多生理過程的機制、攻克人類疾病意義重大。微流控芯片已成為細胞研究的新型平臺，本文將微流控芯片用于細胞鈣信號的研究，取得了以下創(chuàng)新性結(jié)果：
　　 ⑴搭建了一套基于微流控多路層流的細胞局部給藥系統(tǒng)并用來化學(xué)誘導(dǎo)細胞間鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即鈣波。細胞經(jīng)負(fù)壓脈沖引入Y形微通道并精確

2、定位在靶區(qū)域內(nèi)，待細胞貼壁后，用鈣離子熒光探針孵育細胞。根據(jù)靶細胞與通道內(nèi)壁的距離設(shè)置微注射泵的流量速度，正壓驅(qū)動三磷酸腺苷（ATP）和緩沖液流體進入微通道形成兩路層流，使得靶細胞的局部暴露于ATP中、毗鄰細胞暴露于緩沖液中。發(fā)現(xiàn)鈣信號從靶細胞傳遞到毗鄰細胞中，且傳遞方向和流體方向相反，說明該鈣波并不是由靶細胞釋放ATP擴散到毗鄰細胞介導(dǎo)的；當(dāng)在緩沖液中加入辛醇抑制間隙連接后，鈣波消失，說明鈣波主要是由間隙連接介導(dǎo)的。
　　 ⑵

3、利用雙負(fù)壓系統(tǒng)實現(xiàn)了化學(xué)藥物毫秒刺激單細胞。細胞經(jīng)相同的負(fù)壓脈沖接種于十字微通道的靶區(qū)域內(nèi)，控制通道出口端的兩路負(fù)壓使得微通道中ATP和緩沖液的流體狀態(tài)在水力門控和水力聚焦之間快速切換，在靶細胞附近發(fā)生快速溶液交換（17 ms），形成毫秒長短的ATP脈沖流經(jīng)細胞。結(jié)果表明20 μM ATP刺激細胞100 ms使得細胞表面受體脫敏最小化，受體在50 s內(nèi)即可完全恢復(fù)活性，從而實現(xiàn)同一個細胞對照試驗。固定ATP濃度為20 μM，變化刺激時間

4、從50 ms到100 ms再到1 s，鈣峰峰高持平；固定刺激時間為100 ms，變化ATP濃度從2 μM到20 μM再到200 μM，鈣峰峰高遞增，嚴(yán)格證明了ATP誘導(dǎo)的鈣釋放是濃度依賴的。然而，當(dāng)ATP在低濃度時，變化刺激時間從30 ms到50 ms再到100 ms，鈣峰峰高遞增，揭示ATP誘導(dǎo)的鈣釋放又是時間依賴的。
　　 ⑶利用雙負(fù)壓系統(tǒng)實現(xiàn)了對細胞化學(xué)微環(huán)境的時空控制，建立了一種研究細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新方法。水力門控和水力