藥物性肝損傷體外篩選模型和何首烏致肝損傷的初步研究.pdf

1、藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury, DILI)常常是藥物研發(fā)失敗、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此，無論是上市前還是上市后，對有肝損傷風險的藥物，建立有效、靈敏、特異的體外DILI篩選模型顯得尤為重要。
　　何首烏作為傳統(tǒng)補益類中藥的一種，使用十分廣泛。藥物不良反應數(shù)據(jù)顯示，它具有明顯的肝損傷風險。雖然國內(nèi)外近年來進行了一些基礎性研究，但毒性成分目前仍不清楚。因此，需要對何首烏致肝損傷毒性

2、成分及其可能的作用機制進行研究。
　　首先，開展五種肝細胞體外模型的比較研究。選擇對乙酰氨基酚、卡馬西平、雙氯芬酸鈉、異煙肼、丙戊酸鈉、鹽酸胺碘酮、鹽酸四環(huán)素、利福平、依托泊苷、鹽酸拉貝洛爾、達那唑、雷公藤甲素、野百合堿和黃獨素B共14個藥物為DILI陽性對照，鹽酸班布特羅、鹽酸丁螺環(huán)酮和丁溴酸東莨菪堿共3個藥物為DILI陰性對照，采用CCK-8細胞毒性篩選、高內(nèi)涵篩選和肝相關生化指標篩選等方法，對L-02、HepG2、HepaR

3、G和hiHeps等四種人源肝細胞系和一種原代大鼠肝細胞(Primary rat liver cells，PRLs)進行比較研究。結果表明，HepaRG肝細胞系鑒別DIIL藥物的能力最高，并依鑒別DILI藥物的能力將其排序為HepaRG＞L-02＞HepG2=hiHeps＞ PRLs。HepaRG肝細胞在檢測氧化應激、線粒體損傷以及內(nèi)質網(wǎng)應激等方面靈敏性較高，呈劑量依賴性，優(yōu)于其他四種肝細胞。在相關性分析和顯著性檢驗中，谷草轉氨酶(Asp

4、artate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)可同時反映雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環(huán)酮和達那唑對HepaRG肝細胞的影響，提示可以作為探索DILI藥物的肝損傷相關生物標志物。
　　其次，對何首烏致肝損傷成分進行研究。一方面，我們對何首烏藥材進行提取和分離，得到何首烏70％總醇提物和8個提取組分;另一

5、方面，選擇易于獲得的何首烏所含的16個單體成分作為研究對象。采用CCK-8細胞毒性篩選、UPLC-PAD含量測定以及肝相關生化指標測定等方法，對何首烏70％總醇提物、8個提取組分和16個單體成分進行毒性組分和毒性成分的研究。結果表明，第四組分(Fraction4,Fr.4)可能為何首烏致肝損傷的毒性組分，沒食子酸、白藜蘆醇、大黃素、大黃酸為何首烏中具有明顯細胞毒性的單體成分。結合L-02肝細胞損傷特征分析和含量分析，推測沒食子酸可能是何

6、首烏致肝損傷的主要成分之一。此外，谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GLDH）和γ-谷氨酰轉肽酶(γ-Glutamyl transferase，γ-GT)都反映何首烏70％總醇提物和沒食子酸對肝細胞的損傷作用。
　　最后，對沒食子酸致肝細胞損傷的初步機理進行研究。分別從細胞周期、細胞凋亡、高內(nèi)涵篩選（活性氧、線粒體膜電位、內(nèi)質網(wǎng)應激、中性脂代謝和鈣離子穩(wěn)態(tài)）、二維凝膠電泳技術結合分子生物學驗證，探索沒食

7、子酸在不同劑量和不同時間下對HepaRG肝細胞損傷的機理。結果表明，沒食子酸對HepaRG肝細胞的細胞周期沒有顯著影響;沒食子酸呈劑量依賴性的誘導HepaRG肝細胞凋亡;沒食子酸呈劑量依賴性和時間依賴性的誘導HepaRG肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激、降低細胞內(nèi)活性氧水平和鈣離子濃度，對線粒體膜電位和中性脂代謝沒有顯著影響;沒食子酸(0.5mM)在不同時間（24h和48h）處理HepaRG肝細胞，共篩選出11個差異蛋白，其中24h組有6個差異蛋白，4

8、8h組有5個差異蛋白。結合GO和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)24h處理組主要集中在內(nèi)質網(wǎng)中功能蛋白的折疊和加工方面，48h處理組主要集中在功能蛋白折疊加工、功能蛋白前體RNA核糖核酸的調(diào)控、炎癥過程、宿主防御等方面;分子生物學驗證結果表明肽基脯氨酰順反異構酶(Peptidyl-prolylcis-trans isomeraseA，PPIA)的蛋白表達一致性和基因水平表達的一致性，推測PPIA可能是沒食子酸潛在的調(diào)控靶點。
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