二聚體突變引物定量PCR技術的研發(fā)及其臨床應用.pdf

1、實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)技術分為內摻式染料技術和探針技術兩類。內摻式染料技術方法簡單，成本較低，但特異性差，故不適于臨床檢測。探針技術采用了基于熒光淬滅原理或熒光共振能量轉移(fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET)的探針，包括TaqMan探針、Amplifluor探針、分子信標、蝎型探針等。這些

2、探針均是在與模板互補的同一寡核苷酸鏈上，分別標記熒光基團和淬滅基團，特異性高，定量準確，因而被廣泛應用于臨床診斷中。但這些探針均屬于多標記探針，其合成難度和成本較高，制約了其推廣應用。不少研究人員試圖采用單標記探針來降低合成難度和成本，如雜交探針(hybridization probes)和熒光置換探針(displacing probes)，取得了較好效果。但為防止探針與靶序列雜交引起自身延伸而被破壞，仍然需要在探針末端磷酸化來阻斷其延

3、伸，因此，并非真正意義的單標記探針技術。
　　 基于上述分析，本課題設計了一種全新的二聚體突變引物，其具有獨特的結構，為真正意義的單標記探針。與其它多標記熒光探針相比，二聚體突變引物有以下優(yōu)點：
　　 1.結構上具有天然的“熱啟動”功能，增加了方法的特異性；
　　 2.熒光報告基團和淬滅基團空間距離近，報告基團可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴增開始兩者便徹底分離，產生的熒光信號強，增加了方法的靈敏度；

4、>　　 3.真正實現(xiàn)熒光探針的單標記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。
　　 這種新型定量檢測系統(tǒng)既具有染料法對新生雙鏈DNA均能示蹤、成本低的特點，又具有探針法高特異性，是一種高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡單、價廉的新型real-time PCR技術。
　　 我們選取乙型肝炎病毒和沙眼衣原體為具體研究對象，系統(tǒng)地對二聚體突變引物技術進行方法學和臨床應用價值評價。證實二聚體突變引物技術具有高靈敏度、寬線性范圍

5、、重復性好、檢測成本低等優(yōu)點，可用于臨床病原體檢測或流行病學調查研究。
　　 第一部分、新型二聚體突變熒光引物定量PCR檢測HBV方法的建立及臨床應用
　　 目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA定量檢測的方法多為TaqMan探針技術，該技術具有敏感度高和特異性好等優(yōu)點而廣泛應用于臨床。但是TaqMan探針技術有兩個明顯的缺點：一是報告基團和淬滅基團同時標記同一寡核苷酸鏈的兩端，合成與純化

6、難度較大，導致成本較高；二是必須通過Taq水解酶延伸水解探針，造成檢測時間較長。我們將報告基團和淬滅基團分別標記在互補的兩條單鏈寡核苷酸上，設計出二聚體突變引物探針，以克服TaqMan探針標記和純化難度大等缺點，降低成本；另一方面在檢測步驟上可省去酶水解過程，縮短檢測時間。本文欲建立一種基于該二聚體突變引物的快速、準確、價廉、操作簡單的HBV DNA熒光定量PCR檢測方法。
　　 方法：根據(jù)HBV基因組保守區(qū)域precore/c

7、ore設計二聚體突變引物，用PMD-18T系統(tǒng)構建重組質粒作為標準品，優(yōu)化定量PCR體系。采用5個標準品系列，分別測定其批內變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)(CV)；系列稀釋標準品質粒通過概率分析檢測其靈敏度；采用確診的非乙肝病毒性肝炎患者標本30例，其中甲肝5例、丙肝20例、戊肝5例，以及30例健康志愿者血清評價其特異性；所有病例乙肝血清標志物無異常且丁肝抗體陰性，健康志愿者HBsAg陰性并且血清ALT水平正常。病例組收集乙肝病人或者乙

8、肝攜帶者標本共211例，根據(jù)乙肝血清免疫標志物和ALT水平，將所有病例分為4組：41份HBsAg陽性標本(ALT持續(xù)升高)，42份抗HBe抗體陽性標本(ALT持續(xù)升高)，36份抗HBe抗體陽性標本(ALT正常)，85份HBsAg陽性無癥狀攜帶者標本(ALT正常)。對上述211例標本同時以本法及達安公司HBV定量PCR檢測試劑盒法測定HBV DNA水平，進行方法學對比。通過ROC曲線評價本方法對乙肝患者和攜帶者的鑒別診斷能力。另外，為評價

9、本法在乙肝治療過程中的監(jiān)測作用，我們選用1例慢性乙肝急性復發(fā)病人，采用本法監(jiān)測病人在抗病毒治療期間變化，與血清ALT水平聯(lián)合評價患者對抗病毒治療的反應。
　　 結果：成功構建了作為DNA標準品的含有HBV保守序列的重組質粒；建立了利用二聚體突變熒光引物的熒光定量PCR方法。該方法在102～107copies/ml范圍內具有良好的線性(R2=0.994)，最低檢測限為56 copies/ml，特異性為100％，批內CV在0.70％

10、～7.8％之間，批間CV在0.78％～9.02％之間。本法的HBV DNA定量結果與達安公司試劑盒定量結果具有明顯的相關性(R2=0.95)。ROC曲線下面積為0.977，區(qū)分乙型肝炎患者和乙型肝炎攜帶者的cut-off值為1240copies/ml，特異性為96.3％，靈敏度為100％，具有很好的臨床診斷性能。各組病人的HBV DNA含量通過回歸分析比較，發(fā)現(xiàn)各組間具有顯著差異，HBV DNA定量檢測數(shù)據(jù)可作為對病人病情嚴重程度的評價

11、指標。本法監(jiān)測病人抗病毒治療期間的HBV DNA水平變化與血清ALT水平變化趨勢一致，但可比ALT更早預測病人抗病毒治療的效果。
　　 結論：本文建立了基于二聚體突變引物為基礎的新型HBV DNA實時定量PCR檢測方法，可為臨床對乙肝病人進行診斷、治療監(jiān)測和預后判斷提供可靠的定量數(shù)據(jù)，并可進一步開發(fā)為檢測試劑盒。
　　 第二部分、新型二聚體突變引物定量檢測沙眼衣原體方法的建立
　　 目的：檢測沙眼衣原體(Chla

12、mydia trachomatis，CT)的方法有細胞培養(yǎng)法和免疫學方法，前者操作復雜、靈敏度低，后者靈敏度不高，特異性差，兩者在臨床應用均受限制。目前多使用分子診斷技術檢測沙眼衣原體，具有靈敏度度高和特異性好等優(yōu)點而廣泛應用于臨床。但是，常用的TaqMan探針技術存在成本較高、檢測時間較長的缺點。本部分內容擬建立比TaqMan探針技術性能更加優(yōu)越的二聚體突變引物技術用于臨床定量檢測沙眼衣原體。
　　 方法：以我們前期構建含CT

13、主要外膜蛋白(major outer membraneprotein，MOMP)部分序列的重組質粒作為DNA標準品，設計二聚體突變引物，優(yōu)化定量PCR體系。采用4個標準品系列計算批內變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)(CV)判斷方法的重復性；采用肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、15種標準血清型CT及多種生殖道常見病原體對其特異性進行測定；兩種FDA認證的分子診斷方法(羅氏和雅培沙眼衣原體定量檢測試劑盒)分別對148例臨床生殖道標本進行檢測，以新的

14、CT“擴大金標準”為診斷金標準，對本檢測方法的臨床檢測性能進行評價。
　　 結果：建立了二聚體突變熒光引物的定量PCR方法，其線性范圍為101～109 copies/μl，靈敏度為10 copies/μl；特異性為100％；低濃度樣品的批內重復性CV為4.71％，批間CV為5.57％；高濃度樣品的批內CV為3.20％，批間CV為3.66％；能夠檢測出所有血清型沙眼衣原體，而其他常見生殖道病原菌檢測結果均為陰性；對確診的148份臨