輕微肝性腦病代謝組學(xué)的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 肝性腦?。╤epaticencephalopathy，HE）是肝功能嚴(yán)重失調(diào)或障礙所致、以代謝紊亂為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)綜合征。有肝功能失調(diào)或障礙（病史、臨床表現(xiàn)和生化異常）的患者，出現(xiàn)神經(jīng)、精神方面的異常，如意識(shí)障礙、行為失常和昏迷以及神經(jīng)系統(tǒng)體征，在排除其他大腦或精神疾病后，即可診斷為肝性腦病。輕微肝性腦病(minimalhepaticencephalopaMHE)指在沒有臨床證據(jù)證實(shí)肝性腦

2、病的肝硬化患者中可觀測到的認(rèn)知功能、大腦神經(jīng)化學(xué)/神經(jīng)傳遞穩(wěn)態(tài)、新陳代謝、電生理學(xué)參數(shù)、大腦血流和體液穩(wěn)態(tài)的輕微改變。患者形似正常，但操作能力和應(yīng)急反應(yīng)能力減低，在從事駕駛、高空作業(yè)、機(jī)械操作等工作容易發(fā)生意外，在肝硬化患者中的患病率為30％-80％。此型越來越引起人們的高度重視，但目前尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，迫切需要一種客觀、簡單、特異性高的生化學(xué)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床診斷輕微肝性腦病。
　　 代謝組學(xué)是近年來發(fā)展起來的一門新學(xué)科，不僅用

3、于定量描述生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體變化水平，也可用于疾病的診斷。代謝組研究的一個(gè)重要部分為比較分析健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下小分子代謝物表達(dá)的差異，從而有助于人們尋找各種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物(biologicalmarker)，并可用于疾病預(yù)后及治療效果的評(píng)判。肝臟是機(jī)體內(nèi)負(fù)責(zé)能量合成和物質(zhì)代謝的中心器官，肝功能嚴(yán)重障礙時(shí)，肝臟物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，代謝產(chǎn)物發(fā)生相應(yīng)的變化，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)，導(dǎo)致肝性腦病的發(fā)生。
　　 本研究

4、采用高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQ-OrbitrapMS)技術(shù)來分離并提取臨床肝性腦病、輕微肝性腦病、排除肝性腦病的肝硬化及正常對(duì)照組患者血清中的代謝產(chǎn)物，以期找出四者間差異最大的代謝產(chǎn)物作為輕微肝性腦病的標(biāo)志物。
　　 方法:
　　 1、隨機(jī)選取2012年10月-2012年12月于大連市第六人民醫(yī)院住院的至少接受5年教育的肝硬化患者38例。選取健康人33例為正常對(duì)照組。
　　 2、對(duì)所有

5、肝硬化患者進(jìn)行血氨、肝功能、凝血酶原時(shí)間及B超檢測。同時(shí)行Child-pugh分級(jí)。
　　 3、血清標(biāo)志物檢測:高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜(UPLC/LTQ-OrbitrapMS)技術(shù)檢測肝硬化患者、健康對(duì)照患者血清中的代謝產(chǎn)物，找出輕微肝性腦病的代謝產(chǎn)物標(biāo)志物群。
　　 3.1樣品準(zhǔn)備:室溫下靜置解凍血清，取100ul血清放入400ul乙腈，劇烈震蕩30秒，靜置10分鐘后以4℃，14,000×g離心10分鐘，

6、取上清液450ul置冷凍濃縮儀凍干。
　　 3.2超高效液相色譜分析:采用超高效液相色譜分析儀。沖洗柱采用10cm×2.1mm×1.7umC18柱以梯度變化的乙腈溶液沖洗，由于不同物質(zhì)在柱內(nèi)停留時(shí)間不同，從而達(dá)到分離代謝產(chǎn)物的目的。
　　 3.3高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜（UPLC/LTQ-OrbitrapMS）:采用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜分析儀，對(duì)分離的代謝產(chǎn)物進(jìn)行ESI+模式操作。
　　 4、

7、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SSPS18.0統(tǒng)計(jì)軟件將入選病例的肝功能及血氨值進(jìn)行非參檢驗(yàn)，P＞0.05表明入選的病例中各組數(shù)據(jù)間差異性不大，P＜0.05說明各組數(shù)據(jù)間差異大。經(jīng)MicromassMarkerLynx獲取每峰停留時(shí)間(tr)和m/z數(shù)據(jù)對(duì)，每峰離子密度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化輸出后，進(jìn)行主成分分析(PCA)。通過非參檢驗(yàn)，找出差異較大的代謝產(chǎn)物。
　　 5、確定代謝產(chǎn)物名稱:采用精確分子量查找代謝產(chǎn)物名稱
　　 結(jié)果:

8、r>　　 1、入選肝硬化患者38例，其中合并HE12例，占32％;合并MHE11例，占29％;說明肝性腦病的發(fā)病率較高。
　　 2、對(duì)比分析了三組肝硬化患者的血氨、肝功能，發(fā)現(xiàn)血氨值不能有效區(qū)分MHE與HE，血氨不能作為MHE的有效監(jiān)測指標(biāo)。肝功能的炎癥損傷程度及合成功能與肝性腦病的發(fā)生無明顯相關(guān)性。
　　 3、對(duì)所有肝硬化患者進(jìn)行了Child-pugh分級(jí)，發(fā)現(xiàn)肝硬化Child-pugh分級(jí)與肝性腦病無明顯相關(guān)性，肝

9、性腦病的發(fā)生與肝代償功能與無明顯相關(guān)性。但在發(fā)生肝性腦病患者中，肝性腦病的輕重與Child-pugh分級(jí)有關(guān)。
　　 4、通過代謝物峰譜及離子強(qiáng)度圖、PCA模型及PLS-DA模型對(duì)正常人、單純肝硬化患者、HE和MHE患者血清代謝譜的比較中發(fā)現(xiàn)，胍氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、苯丙氨酸二肽、高香草酸、鳥氨酸、L-絲氨酸在正常人、單純肝硬化及肝性腦病患者中呈逐漸增高的趨勢，次黃嘌呤在正常人、肝硬化及肝性腦病患者中呈逐漸下降趨勢。與H

10、E患者相比，MHE患者血清中改變的代謝物質(zhì)與HE大部分相似。
　　 結(jié)論:
　　 1.肝性腦病在肝硬化患者中的的發(fā)病率高，血氨不能作為MHE的診斷指標(biāo)。肝功能的炎癥損傷程度及合成功能與肝性腦病的發(fā)生無明顯相關(guān)性。
　　 2.肝硬化Child-pugh分級(jí)與肝性腦病無明顯相關(guān)性。在發(fā)生肝性腦病者中，肝性腦病的輕重與Child-pugh分級(jí)有關(guān)。
　　 3.胍氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、苯丙氨酸二肽、高香草