NF-κBp65反義寡核苷酸對(duì)TNBS誘導(dǎo)BALB-C小鼠慢性結(jié)腸炎腸道纖維化的影響.pdf

1、背景：炎癥性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是一組病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚的胃腸道慢性炎癥性疾病，以慢性炎癥和反復(fù)發(fā)作為特征。而克羅恩病又以腸道透壁性炎癥為特點(diǎn)，長(zhǎng)期的慢性炎癥導(dǎo)致腸道大量異常的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而引起腸壁纖維化狹窄，并最終導(dǎo)致腸梗阻。40％以上的克羅恩患者會(huì)有不同程度的腸梗阻，而其中大約有80％的患者最終需要內(nèi)鏡或外科手術(shù)治療，效果卻不盡人意。然而，目前炎癥性腸病腸道發(fā)生纖維化的機(jī)制不明確且臨床上仍缺乏有效的治療藥物

2、。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)NF-κBp65反義寡核苷酸具有下調(diào)NF-κB表達(dá)作用，從而下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，起到抑制炎癥的作用，如果其可以有效減輕實(shí)驗(yàn)性慢性結(jié)腸炎動(dòng)物模型腸道纖維化，無(wú)疑有望成為治療炎癥性腸病抗炎抗纖維化的生物制劑。
　　 目的：探討預(yù)防性NF-κBp65反義寡核苷酸灌腸對(duì)TNBS/酒精誘導(dǎo)BALB/C小鼠慢性結(jié)腸炎腸道炎癥及纖維化的影響。通過(guò)觀察各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)，分析結(jié)腸組織學(xué)病理變化、膠原纖維增生程度、NF-κBp65、

3、TNF-α的表達(dá)水平，研究NF-κBp65反義寡核苷酸預(yù)防性應(yīng)用在抗慢性結(jié)腸炎腸道炎癥及纖維化中的作用，進(jìn)而探討NF-κBp65反義寡核苷酸的作用機(jī)制，為炎癥性腸病腸壁纖維化基因治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：將體重約20-24克BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分成四組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、TNBS模型組(TNBS組)、NF-κBp65反義寡核苷酸預(yù)防治療組(ASOND組)、NF-κBp65錯(cuò)義寡核苷酸陰性對(duì)照組(MSOND組

4、)?？瞻讓?duì)照組每周僅給予生理鹽水100ul灌腸1次，連續(xù)6周。而TNBS組、ASOND組、MSOND組分別先給予生理鹽水100ul、25nmolNF-κBp65反義寡核苷酸100ul、25nmolNF-κBp65錯(cuò)義寡核苷酸100ul灌腸，于次日給予2mgTNBS+50％酒精100ul灌腸，連續(xù)6周。所有組別于最后一次灌腸后1周處死小鼠，采集結(jié)腸組織，HE染色評(píng)估小鼠結(jié)腸組織炎癥程度、VG染色評(píng)估小鼠腸道纖維化程度、免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠

5、結(jié)腸組織NF-κBp65蛋白及TNF-α蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：⑴每次TNBS灌腸24小時(shí)內(nèi)小鼠即出現(xiàn)少動(dòng)、少食等癥狀，持續(xù)2-3天后有所減輕，前3周最為重，且每組均有小鼠死亡，第4周起癥狀相對(duì)穩(wěn)定，且死亡小鼠明顯減少；體重在灌腸后2-4天下降，隨后穩(wěn)定甚至增加?？瞻讓?duì)照組不出現(xiàn)上述癥狀，體重呈進(jìn)行性增加。與空白對(duì)照組比較，TNBS組、MSOND組、ASOND組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index

6、，DAI)評(píng)分均增高(P<0.05)，而ASOND組DAI評(píng)分低于TNBS組和MSOND組(P<0.05)。⑵肉眼觀察各組小鼠結(jié)腸標(biāo)本，空白對(duì)照組可見正常結(jié)腸組織，無(wú)充血、水腫，觸之柔軟性好，而TNBS組、MSOND組可見充血、水腫的結(jié)腸組織，病變結(jié)腸僵硬、變形、腸腔變窄，個(gè)別可見腸管粘連、腸管變短，PP淋巴結(jié)增大。而ASOND組小鼠結(jié)腸組織無(wú)明顯充血、水腫，腸管無(wú)明顯的變形、變短，觸之柔軟性尚可。除空白對(duì)照組外，三組小鼠腸道均可見不同

7、程度的炎癥表現(xiàn)，如結(jié)腸組織固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩破壞、杯狀細(xì)胞減少等。TNBS組和MSOND組炎癥評(píng)分明顯高于ASOND組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而ASOND組與空白對(duì)照比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑶TNBS組和MSOND組結(jié)腸組織鏡下可見固有肌層明顯增厚，大量膠原纖維沉淀于粘膜下，而ASOND組纖維增生較輕。與空白對(duì)照組和ASOND組比較，TNBS組和MSOND組纖維化明顯(P<0.05)，ASOND組較空白對(duì)照組增生

8、明顯(P<0.05)。⑷各組小鼠結(jié)腸組織中均可發(fā)現(xiàn)NF-κB p65蛋白表達(dá)，但空白對(duì)照組和ASOND組明顯低于TNBS組和MSOND組(P<0.05)，而前兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，前兩組陽(yáng)性細(xì)胞主要存在于上皮細(xì)胞，且以胞漿著色為主，而后兩組陽(yáng)性細(xì)胞主要在固有層，且以胞核著色為主。⑸與空白對(duì)照組和ASOND組比較，TNBS組和MSOND組小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α蛋白表達(dá)均增高(P<0.05)，而空白對(duì)照組與ASO

9、ND組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：①通過(guò)對(duì)TNBS組小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)的觀察、結(jié)腸病理及結(jié)腸纖維化增生程度的分析，證實(shí)2mgTNBS+50％酒精誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎及腸壁纖維化動(dòng)物模型建立成功。②NF-κBp65反義寡核苷酸可下調(diào)NF-κBp65蛋白和TNF-α蛋白表達(dá)，NF-κBp65錯(cuò)義寡核苷酸無(wú)以上作用。③NF-κBp65反義寡核苷酸可減輕小鼠腸道炎癥和腸壁纖維化，而NF-κBp65錯(cuò)義寡核苷酸無(wú)此生物學(xué)效